[发明专利]几丁质酶材料和方法

说明书

这是1996年6月14日提交的美国申请序号08/663,618的部分继续。

                       发明领域

本发明总的来说涉及人几丁质酶，更确切的说是涉及纯化的和分离的编码人几丁质酶的多核苷酸、所述核苷酸所编码的几丁质酶产物、重组生产几丁质酶产物的材料和方法和对该几丁质酶专一性的抗体物质。

                         背景

几丁质是一种β-(1,4)-连接的N-乙酰氨基葡萄糖残基的线状同聚物。该多糖仅次于作为最丰富有机物质的纤维素。节肢动物的外骨骼是由几丁质组成的。另外，真菌和其它的寄生物在它们的外部细胞璧中含有几丁质，在细胞壁中几丁质行使重要的结构和保护作用。破坏真菌的细胞壁和膜已成为对付真菌和寄生物的有用的治疗方案。例如两性霉素和氟康唑通过作用于膜类固醇来行使它们的抗真菌活性。尽管有这些抗真菌疗法，但人类的真菌感染已日益成为威胁生命的疾病的主要原因。参见Geogopapadakou等，Trends Microbiol.,3:98-104(1995)。导致这些疾病的真菌种类和寄生物主要是：念珠菌属、曲霉属、隐球菌属、组织浆菌属、球孢子菌属和肺囊虫属。这些病原体对无免疫应答的个体，例如艾滋病病人、正在进行化疗的病人和免疫抑制器官移植病人特别危险。

几丁质能被几丁质酶降解。在植物、微生物和动物中发现几丁质酶。细菌几丁质帮助提供细胞生长的碳源。昆虫在每次蜕皮时产生几丁质酶来消化它们的角质层。在植物中，几丁质酶被认为为抵抗寄生性真菌提供保护作用。几丁质酶已经从许多细菌[例如粘质沙雷氏菌，Jones等，EMBO J,5:467-473(1996)]、植物[例如烟草，Heitz等，Mol.Gen.Genet.,245:246-254(1994)]和昆虫[例如黄蜂，Krishnan等，J.Biol.Chem.,269:20971-20976(1994)]物种中克隆出来。

已经在哺乳动物中鉴定出与细菌、昆虫和植物的几丁质酶具有低同源性(低于40％的氨基酸同一性)的几种蛋白质，例如人软骨gp-39(C-gp39)[Hakale等，J.Biol.Chem.,268:25803-25810(1993)]、人糖蛋白YKL-40[Johansen等，Eur.J.Cancer,31A:1437-1442(1995)]、来源于绵羊[DeSouza等，Endocrinology,136:2485-2496(1995)]、奶牛、人类的输卵管专一性的雌激素诱导的蛋白质以及来源于激活的鼠巨噬细胞的分泌蛋白质[Chang等，基因库M94584]。然而，还没有报道这些蛋白质的几丁质-降解活性。这些蛋白质的功能是未知的，但是已经假设它们参与组织重建(remodeling)。Hakala等(见上述)报道：在来源于类风湿性关节炎病人的滑膜和软骨的样本中可检测到C-gp39，但对于正常人未检测到。Rechlies等，Arthritis Rheumatism,36(9 SUPPL.):S190(1993)报道了将C-gp39蛋白质定位于软骨浅层的一独特的细胞群体上。Johansen等(见上述)报道：测定YPL-40血清水平作为复发性乳腺癌病人的转移性疾病和存活的程度的有潜力的预后标记是有价值的。

Fscott等，Infect.Immun.,63:4770-4773(1995)在白细胞和人血清中证实了几丁质酶的活性。Overdijk等，Glycobiology,4:797-803(1994)描述了从人血清和大鼠肝脏中分离一种几丁质酶(4-甲基伞形基(lumbelliferyl)-四-乙酰壳四糖苷水解酶)。Renkema等，J.Biol.Chem.,270:2198-2202 (1995年二月)从高歇氏病病人的脾脏中制备出人壳三糖苷酶。他们的制备物显示有几丁质酶活性，并且该论文报道了该制备物的蛋白质组分的一小部分氨基酸序列(22个氨基末端残基和胰蛋白酶片段的21个残基)。人几丁质酶的功能也是未知的，但在此论文中提出了几丁质酶与高歇氏病的病理学关系。该小组最近发表的论文[Boot等，J.Biol.Chem.,270(44):26252-26256(1995年11月)]，描述了编码显示有几丁质酶活性的产物的人巨噬细胞cDNA的克隆。该小组在1995年2月的论文中所报道的部分氨基酸序列与推断出的人巨噬细胞cDNA产物的氨基酸序列部分相吻合。另参见国际专利公布号WO96/40940。