[发明专利]产生雌性不育植株的方法

说明书

本发明涉及在采用组织特异性启动子的同时使用脱乙酰基酶基因(dea基因)制备转基因植物。在这些转基因植物中，可以有意地阻止特定植株部分的发育。

膦丝菌素(PCT,2-氨基-4-甲基膦基丁酸)是谷氨酰胺合成酶(GS)的抑制剂。PTC是抗菌的膦丝菌素丙氨酰丙氨酸(phosphinothricylalanylalanine)(PTT)的“构件”，该三肽(PTT)具有抵抗格兰氏阳性菌、格兰氏阴性菌和真菌灰葡萄孢(Botrytis cinerea)的活性。PTT由绿色产色链霉菌(streptomyces viridochro-mogenes)菌株Tü494合成，该菌株已保藏于德意志微生物保藏中心，保藏号为DSM40736和DSM4112，可从此处获得该菌株。从德国专利说明书2717440中可知PTC作用为完全除草剂。已公开的申请(EP-A-0257542)中描述了如何用膦丝菌素N-乙酰基转移酶(pat)基因来制备除草剂抗性植物。由pat基因编码的膦丝菌素N-乙酰基转移酶修饰细胞内出现的PTC并消除此除草剂的毒性。

在此，本发明描述使用脱乙酰基酶基因(dea)制备雌性不育植株，脱乙酰基酶表达产物能在细胞内使N-乙酰膦丝菌素(N-Ac-PTC)和/或N-Ac-PTT脱去乙酰基，从而恢复它们的抗菌活性。

N-乙酰膦丝菌素三肽脱乙酰基酶基因可从绿色产色链霉菌Tü494中分离。dea基因位于pat基因下游区已知的4.0kb BamHⅠ片段上(EP-A-0257542)。此基因位于BgⅢ/BamHⅠ片段上，并由序列(图1和表1)精确定位。由DNA序列得出蛋白质序列。

可以使用在细菌和植物中识别的ATG密码作为翻译起始密码子；形成ShiHe-Dalgarno(SD)序列。脱乙酰基酶基因编码PTT生物合成中的最后步骤，即使无活性的N-乙酰膦丝菌丝三肽脱去乙酰基以形成有活性的PTT。

已知许多酶的特异性并不限于一种底物。例如，pat基因编码的膦丝菌素N-乙酰基转移酶实际上在PTT的生物合成中用于使脱甲基-PTC乙酰化，并且由于缺少特异性，它可用于消除PTC的毒性。通过过量表达dea基因(使用合适的启动子或通过克隆入高拷贝的载体)，缺乏特异性的N-乙酰基-PTT脱乙酰基酶现已用于活化N-乙酰基膦丝菌素。

可从大肠杆菌中分离到其它dea基因。已发现与其它细菌(如根瘤菌和链霉菌)相反，大肠杆菌中，在pat基因克隆入合适表达载体后，在所谓pat分析[Inge Broer的学位论文，Bielefeld大学生物学系，绿色产色链霉菌(S.viridochromogenes)膦丝菌素N-乙酰基转移酶基因在烟草中的表达，第42-43页，1989]中检测不到活性(Strauch等，基因，63,65-74,1988；Wohlleben等，基因，70,25-37,1988)。此外，当pat基因在大肠杆菌中以低拷贝数存在时，由于内源脱乙酰基酶消除了膦丝菌素N-乙酰基转移酶的作用，所以pat不能赋予对PTT的抗性。最后，脱乙酰基酶的活性可以直接由加入N-乙酰膦丝菌素后出现对GS活性的有效抑制来证明。脱乙酰基酶将N-Ac-PTC转化为PTC，然后PTC以已知方式抑制GS，这种抑制可在γ-谷氨酰转移酶分析中得到测定(Bender等，细菌学杂志，129,1001-1009,1977)。这是由于大肠杆菌具有内源脱乙酰基酶活性。

从文献中可知大肠杆菌的argE突变体中明显不存在脱乙酰基酶的活性(Baumberg,Molec.Gen.Genetics,106,162-173,1970)。其它大肠杆菌脱乙酰基酶突变体也容易在经典的诱变(Delic等，Mut.Res.,9,167-182,1970；Drake和Baltz，生物化学年鉴，45,11-38,1976)或Tn5诱变(Kleckner，遗传学年鉴，15,341-404,1981)后进行筛选。这样的突变体可在加有PTT的基本培养基上得到鉴定，这是因为只有它们能在用克隆入低拷贝数载体的pat基因转化以后生长。

因此大肠杆菌脱乙酰基酶基因可以通过使用常规方法(Maniatis等，分子克隆：实验手册，Gold Spring Harbor Laboratory,Cold SpringHarber,New York,1982)例如在大肠杆菌argE突变体中或在新分离的突变体中构建基因文库来分离。

分离其它脱乙酰基酶基因的方法可从上述方法推出，即：分离新的尽管存在低拷贝数载体上的pat基因但仍对PTT敏感的生物体，随后分离脱乙酰基酶基因。