[发明专利]新型磷脂酶,及其生产和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种新型磷脂酶，其编码DNA序列及其生产和应用。

背景技术

磷脂，如卵磷脂或磷脂酰胆碱，由在第一位(Sn-1)和第二位(Sn-2)被两分子脂肪酸酯化并在第三位被磷酸酯化的丙三醇组成；该磷酸相应地可被氨基酯醇化。磷脂酶是参与磷脂水解的酶类。磷脂酶活性可分为几种类型，包括磷脂酶A1和磷脂酶A2，它们可水解一个脂肪酰基(分别在Sn-1位和Sn-2位)，形成溶血磷脂；而溶血磷脂酶(或磷脂酶B)则水解溶血磷脂中剩下的脂酰基。本发明涉及一种能够水解磷脂中所有脂酰基的磷脂酶。具有这种活性的酶类有时也被称为磷脂酶B。

已报导的具磷脂酶B活性的酶类来自于多种真菌，包括特异青霉[也称为产黄青霉；N.Kawasaki.《生化杂志》(J.Biochem.),77,1233-44,1975；N.Masuda等，《欧洲生化杂志》(Eur.J.Biochem.),202,783-787,1991]，酿酒酵母[M.Ichimasa等，《农业生物化学》(Agric.Biol.Chem.),49(4),1083-89,1985；F.Paultauf等，《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)，269,19725-30,1994]，戴尔有孢圆酵母[旧称罗斯酵母，Y.Kuwabara,《农业生物化学》，52(10),2451-58,1988；《FEMS，微生物学通讯》(FEMS,Microbiol.Letters),124,29-34]；粟酒裂殖酵母[H.Oishi等，《生物科学、生物技术和生物化学》(Biosci.Biotech.Biochem.),60(7),1087-92,1996]，黑曲霉[《技术简报》(Technical Bulletin),G-zyme^TMG999，酶学生物系统有限公司(Enzyme Bio-SystemsLtd.)和刺孔伏革菌[S.Uehara等，《农业生物化学》，43(3),517-525,1979]。

已知磷脂酶可用于例如油脂的酶促脱胶(US5,264,367,Metallgesellschaft公司，Rohm)，淀粉水解产物(特别是小麦淀粉的水解产物)的后处理以提高过滤通透能力(EP219,269,CPC International)，还可用作面包生面的添加剂以提高面包弹性(US4,567,046,Kyowa Hakko)。

本发明目的在于提供可用于上述方法的一种改良磷脂酶。

本发明陈述

本发明者已发现可从Hyphozyma属株系中获得一种酸性磷脂酶。它能够水解催化完整磷脂中的两个脂酰基团。其优异之处在于，它在非常低的pH条件下有活性，并且无脂酶活性；这些特性使得它非常适用于油脂脱胶，因为油脂的酶促和碱性水解(皂化)此时都受到了抑制。该酶为非膜结合型，使其适于商业化生产和纯化。

WO93/24619(Novo Nordisk)公开了一种来自Hyphozymasp.LF-132(CBS648.91)的脂酶，但一直没有关于由该属产生磷脂酶的报道。我们已经发现本发明磷脂酶可从与已知脂酶来源相同的株系中获得，并且可以将这两种酶分离。

相应地，本发明的首要方面在于提供一种已分离的磷脂酶，它来自于Hyphozyma株系，能够水解磷脂中的所有脂酰基团，并在实施例3所述条件下测得在大约50℃和pH3的条件下具有最佳磷脂酶活性。

本发明也提供一种已分离的磷脂酶，它能够水解磷脂中的所有脂酰基团，是一种在其氨基末端包含作为SEQ ID NO:11中所述第1-497位序列的部分氨基酸序列的多肽，或与该序列至少有50％的同一性。

另一方面，本发明提供了一种已分离的磷脂酶，它能够水解磷脂中的所有脂酰基团，是一种含有与SEQ ID NO:1-8所示氨基酸序列有至少50％同一性(不考虑Xaa)的氨基酸序列的多肽。

本发明进一步提供一种分离的编码所述磷脂酶的DNA序列。

本发明另一方面还提供了生产磷脂酶的方法，包括在适当的营养培养基中培养Hyphozyma可产生磷脂酶的一个株系，随后回收磷脂酶。

本发明更进一步提供了生产磷脂酶的方法，包括从可产生磷脂酶的Hyphozyma株系中分离编码磷脂酶的DNA序列，并在合适的载体上将该DNA片段连上适宜的表达信号，用所构建的载体转化适当的异源宿主生物体，在适于磷脂酶表达的条件下培养所转化的宿主生物体，以及从培养液中回收磷脂酶。

本发明还提供了所述磷脂酶在一种方法中的用途，该方法包括用该磷脂酶处理磷脂或溶血磷脂以水解脂酰基团。