[发明专利]含有GAX蛋白中涉及转录抑制和/或与其他蛋白相作用功能域的多肽,相应的核酸及其应用

说明书

本发明涉及治疗性功能域，更具体地涉及一些治疗性新分子和它们治疗心血管疾病的应用。

血管成形术后的再狭窄是一种局部过度增殖性疾病，它连续发展成为不可外科手术的动脉粥样硬化斑。因而，血管成形术治疗动脉粥样硬化损伤经常产生持续性再狭窄导致动脉壁的机械损伤(在一些研究中高达50％)。

血管壁中平滑肌细胞的增殖是动脉粥样硬化的发展中、血管成形术后的再狭窄中以及冠状动脉搭桥的失败中的关键事件。平滑肌细胞正常情况下在细胞壁中是静息的，但在损坏血管内皮的损伤之后，它们重与血中的生长因子接触。与心肌细胞和骨骼肌细胞不同，作为对各种生长因子的反应，平滑肌细胞可以去分化并重新开始它们的增殖循环。平滑肌细胞的这些表型改变源自于一些基因表达水平的重要变化。例如，当其他结构基因如特异平滑肌α-肌动蛋白的表达及肌浆球蛋白的某些同工形式的表达被负调节时，细胞增殖中涉及的一些早熟基因如c-fos或c-myc的表达显著增高。

尽管已清楚地证明骨骼肌细胞的最终分化由一些称为肌原性因子的转录因子如Myo-D调节，但迄今平滑肌细胞的可逆性分化中涉及的已知因子很少。最近的研究揭示，在心血管系统的不同组织中存在具有同源框的转录因子。由于其同源框的缘故，这些因子识别其靶基因启动子区中的特异性DNA序列并参与细胞分化增殖或迁移的调节。这些gax因子(生长抑制特异性同源框，Growth-Arrest-SpecificHomeobox)之一在不同的心血管组织中表达，包括血管壁的血管平滑肌。该gax基因最早从大鼠的主动脉cDNA库中找到。它编码一种303个氨基酸的蛋白。其序列已被鉴定，其cDNA已被克隆(Gorski等，分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)1993,6,3722-3733)。人的gax基因也已被克隆和测序(David F.Le Page等，基因组(Genomics)1994,24,535-540)。它编码一种302个氨基酸的蛋白。该gax基因具有一些与gas和Gadd基因相似的特性，因为它看来也控制细胞周期的G0/G1转换。因而大鼠CMLV中的gax的mRNA水平在与PDGF接触2小时后降低10倍(Gorski等，分子细胞生物学，1993,6,3722-3733)。gax基因的表达因而在CMLV的促有丝分裂反应过程中被抑制。gax基因的另一特征在于其特异性表达。实际上，在成年大鼠中，gax基因绝大部分在心血管系统(主动脉，心脏)中表达。通过Northern印迹没有表明在肝、大脑、胃和骼肌中存在gax的mRNA。另外，该gax基因属于一个同种基因的家族。这些基因编码这样的转录因子，它们含有能识别DNA的特定区域(或同源框)的保守序列(或同源功能域)(见，Gehring等，细胞(Cell),78:211-223,1994)。大鼠gax蛋白的同源功能域含有185-245个氨基酸。有趣的是，迄今已鉴定的这些同种基因均参与胚发生过程中细胞分化/生长的控制，这强化了该gax基因的治疗潜力(见，Lawrence和Morata，细胞78:181-189,1994；Krumlauf，细胞，78:191-201,1994)。

GAX的特征之一是一旦平滑肌细胞增殖它就被负调节，所述平滑肌细胞的增殖是在体外响应于生长因子或是在体内由于细胞壁的内皮损伤。这种抑制是可逆的，因为当通过体外消除血清平滑肌细胞被静息化时GAX的表达又得以恢复。我们实验室的工作最近表明GAX借助于腺病毒载体在平滑肌细胞中的过量表达阻断平滑肌细胞的增殖，FR95/04234(ST95022)。

血管成形术后持继再狭窄致机械损伤代表了最常发生的失败因素(在某些研究中为50％)。平滑肌细胞的增殖是这一现象的一个关键因素，认识到GAX的增殖调节作用，因而GAX看来是在血管成形术后预防性治疗血管壁的可选择的治疗基因，FR95/04234(ST950022)。

但对GAX的作用机制仍很少有报道。GAX同源框的靶DNA序列有待鉴定。另外，迄今还没有进行对GAX各功能域功能的研究。对GAX各功能部分的鉴定最终构成了一个重要方面，从而能够确定GAX所依赖或处于根源的分子反应。

本发明准确的意义在于提供这些方面的信息。

在此工作过程中，采用了不同的分析途径以鉴定与GAX相作用的分子、以确定该相互作用所需要的GAX功能域、及研究不同的功能域在GAX功能中的重要性。为此，使用了双杂合系统，以从一个人肺文库中鉴别出与GAX相作用的蛋白。