[发明专利]用沉子促进热启动核酸聚合酶连锁反应的方法

说明书

本发明涉及生物工程技术领域，特指一种利用沉子促进热启动核酸聚合酶连锁反应使油脂中隔上下层的反应溶液混合的方法。

目前在进行核酸聚合酶连锁反应(简称PCR反应)或结合反转录酶反应(简称RT反应)时，常在反应管E中设置油脂中隔层B，参阅图1和图2，中隔层B的油脂熔点为40-75℃(常用石蜡)，油脂中隔层B在反应前为固相，将上、下层反应溶液A和C隔开，当开始进行反应时，由于温度升高，固相的油脂中隔层13液化，由于油脂的比重小于水，液化的油脂层B应浮于上表面，使上、下层的反应溶液A和C混合进行反应，其存在问题在于实际应用中，由于反应溶液的重力作用以及反应管E的管壁与液化油脂层B的吸附作用，使液化的油脂B即使比重小于水，也不能迅速浮于上表面，而仍滞留在中间位置，阻隔上、下层反应溶液A和C的混合，使反应无法进行。

本发明的目的在于提供一种利用沉子促进热启动核酸聚合酶连锁反应使油脂中隔上、下层的反应溶液混合的方法，克服现有技术的弊端，达到促进反应顺利完成的目的。

本发明的目的是这样实现的：一种用沉子促进热启动核酸聚合酶连锁反应的方法，其特征在于该方法依次包括如下步骤：先将下层反应溶液置入反应管底层；置入低熔点的液态油脂层，降温使该液态油脂层转变成固相油脂层；将上层反应溶液置入该固相油脂层上；将比重2.5、直径1.5-2.0mm的沉子置入该固相油脂层的上面；将上述反应管置入加热器内升温，使该固相油脂层熔化转变成液态，在下沉的沉子的带动下及液化油脂层内聚力和反应管壁吸附作用下，该液态油脂层凝聚在反应管底，或上浮到反应溶液的上表面，且形成火山口形态的缺口，使上、下层的反应溶液混合，促进热启动核酸聚合酶连锁反应。

该沉子包括硅珠、硅粒。

本发明的主要优点是：利用比重2.5，直径1.5-2.0mm的沉子(硅珠)置于固相油脂中隔层的上面，当温度上升固态油脂熔态时，由于沉子的重力使液态的油脂层产生下凹现象，由于反应管壁为嗜油性(或疏水性)，与液态的油脂层保持良好的亲和力，故液化的油脂层沿反应管壁向下移动，当沉子继续下沉时，会出现下述两种情况之一：其一是沉子穿过液态的油脂层下沉到反应管底，液态的油脂层内聚力消失，油脂向反应管壁附着，并因油脂比重小于水，上浮到上表面，且形成火山口状的缺口，便于反应完毕后从该缺口吸取反应液；其二是沉子不穿过液态油脂层，而液态油脂层下凹部分碰触吸附在管底壁，由于液态油脂本身的内聚力和管壁的吸附作用，使油脂层凝聚在管底。上述两种情况都能使反应管内上、下层的反应溶液混合，促进热启动核酸聚合酶连锁反应或结合反转录酶反应，本发明的方法解决了阻隔反应管内的上、下层反应溶液混合的难题，且简便、容易操作，适合广泛应用。

下面结合较佳实施例和附图对本发明进一步说明：

图1为固相油脂中隔上、下反应溶液的示意图；

图2为液态油脂浮于反应溶液上表面的示意图；

图3为本发明的沉子置于固相油脂层上的示意图；

图4为本发明的沉子在液态油脂层上往下沉的示意图；

图5为本发明的沉子带动液态油脂层沉入反应管底的示意图；

图6为本发明的沉子单独沉入反应管底的示意图；

参阅图3-图6，本发明的方法依次包括如下步骤：

(一)取30ul参加热启动核酸聚合酶连锁反应的下层溶液C放入专用反应管E内。

(二)取20ul熔点50-60℃，比重0.9的液态油脂B放入下层溶液C的上面，降温，使液态油脂B转变成固态油脂层B’。

(三)取30ul参加热启动核酸聚合酶连锁反应的上层溶液A放入固态油脂层B上，固态油脂层B’将上、下层反应溶液A和C隔离如图3所示。

(四)取比重2.5，直径1.8mm的硅珠沉了D放到固态油指层B’上表面的中心位置。

(五)将反应管E放入热循环仪中加热升温，当温度升至高于固态油脂层B’的熔点时，固态油脂层B’转变成液态油脂层B，沉子D由于重力作用，使液态油脂层B产生下凹现象如图4所示。当沉子D继续下沉就出现两种情况：其一沉子不穿过液态油脂层B，但液态油脂层B的下凹部碰触反应管E的管底壁，由于液态油脂层B本身的内聚力和管壁的吸附作用，使液态的油脂层B凝聚在反应管的E底部，如图5所示；其二，沉子D穿过液态的油脂层B下沉到反应管E底部，液态的油脂层B内聚力消失，由于油脂的比重小于水，上浮到上表面，中间形成火山口状的缺口如图6所示。上述两种情况都使上、下层的反应溶液A和C混合，达到促进热启动核酸聚合酶连锁反应的功效。本发明的方法还适用于结合反转录酶反应，具有同样的功效。