[发明专利]芽孢杆菌核糖核酸酶基因植物花药特异性表达载体

说明书

本发明涉及植物基因工程领域，即将来自解淀粉芽苞杆菌的Barnase基因置于经过改造过的植物花药特异性表达的嵌合启动子antherbox-CaMV35S-pTA29的控制之下，使其在植物花药绒毡层中特异而高效的表达。利用Barnase基因的RNase活性，破坏植物花药绒毡层，从而导致花粉败育，获得植物雄性不育系。该发明在植物杂交育种上有着广泛的应用前景。

Barnase基因编码一种胞外核糖核酸酶，其产物以前体形式表达，在加工、运输过程中N端被切除约20个氨基酸，成为成熟酶，共有110个氨基酸组成，分子量为12.4KD^[1][2]。

pTA29是来自烟草samsun TA29基因的启动子^[3]。该基因的表达是花药特异性的，其产物集中在花药绒毡层中，一般是在减数分裂后不久就出现，在小孢子有丝分裂之前含量达到最高，在开花期迅速下降。启动子的缺失试验表明，TA29的转录控制序列位于该基因转录起始位点上游的-279～-150之间，这段序列是保证TA29基因在花药绒毡层中高效表达所必需的(Koltunow,1990)。试验表明：pTA29启动子可以控制外源基因在植物花药中特异性的表达。由pTA29-barnase构成的嵌合基因可以导致烟草、油菜等多种植物雄性不育^[4][5][6]。

antherbox是来自矮牵牛类黄酮合成途径中CHI B基因PB启动子中的一段DNA序列，共有26个碱基对组成。该序列高度保守，其作用为调节CHI基因在花药中特异性表达^[7]。此外，该序列还能使组成型表达的CaMV35S启动子在花药中特异性表达^[8]。

该发明的目的之一是增强Barnase基因的花药特异性标达的强度。利用串联启动子可以增强表达的特性^[9]。在pTA29启动子之前串联上CaMV35S启动子，以期增加表达的强度。

该发明的目的之二是利用antherbox可以调节启动子花药特异性表达的特性，在CaMV35S-pTA29嵌合启动子之前串联上antherbox，以增强该嵌合启动子表达的花药特异性，防止Barnase基因在植物的其它组织中表达。

该发明的最终目的是通过构建Barnase基因的植物花药特异性表达载体，利用基因枪和农杆菌侵染的办法，使Barnase基因在植物花药中高效而特异性的表达，从而破坏花药绒毡层，导致花粉败育，获得植物雄性不育系。为两系法育种中雄性不育系的获得提供了一条崭新的途径。

本发明主要包括以下几方面技术：一·烟草总DNA的提取

烟草总DNA的提取(参照王革娇等提供的方法，植物遗传转化技术手册，傅荣昭等，1994)1．取0.5g的新鲜烟草幼叶，加液氮研磨至干粉状，转入事先已放入500ul尿素缓冲液的离心管中(8M尿素，500mM Tris.Cl pH8.0,350mM NaCl,20mM EDTA，抽滤灭菌)。2．摇动离心管，使植物材料于缓冲液充分混合，加入500ul的酚∶氯仿(1∶1)，充分混匀。3．10000rpm离心5分钟，收集上清液，转移到一干净的离心管中，加入500ul的氯仿，重新抽提一遍。4．转移上清液到一干净的离心管中，加入2倍体积冰冷的无水乙醇，混匀，静置沉淀10分钟。5．15000rpm离心5分钟，收集沉淀，用75％的乙醇洗涤一遍，室温干燥10分钟，加入200ul ddH₂O溶解。6．取5ul琼脂糖电泳检测、定量。二·花药特异性基因TA29启动子的聚合酶链式反应(Polymerase ChainReaction PCR)