[发明专利]用于产生有旋光力的化合物的方法

说明书

本发明涉及用于产生(S)-4-羟基-2-酮戊二酸的方法和用于产生可以由前体(S)-4-羟基-2-酮戊二酸形成的化合物(例如，(2S，4S)-4-羟基-L-谷氨酸和(2S，4S)-4-羟基-L-脯氨酸等化合物)的方法。(2S，4S)-4-羟基-L-脯氨酸具有包括抗癌细胞活性[癌症研究48.，2483(1988)]和抗肥大细胞活性(日本未审查专利出版物，No.63-218621)在内的生物学活性。(S)-4-羟基-2-酮戊二酸和(2S，4S)-4-羟基-L-谷氨酸对于产生(2S，4S)-4-羟基-L-脯氨酸是有用的。

人们知道许多产生(S)-4-羟基-2-酮戊二酸的常规方法，包括苏型-4-羟基-L-脯氨酸的化学脱氨作用[酶学方法，17部分B，275]。

本发明的发明人以前曾报导过产生(S)-4-羟基-2-酮戊二酸的方法(日本未审查专利出版物No.7-289284)，该方法包括使(例如，提供)生物催化剂(其具有由丙酮酸产生(S)-4-羟基-2-酮戊二酸的活性)作用于水合乙醛酸和丙酮酸或通过生物催化剂作用能转变为丙酮酸的化合物。与已知的常规方法比较，该方法更有工业产生优势，但该方法的劣势在于，如果用廉价的葡萄糖作为底物则(S)-4-羟基-2-酮戊二酸的积累较少，而必须用昂贵的丙酮酸作为底物才能使(S)-4-羟基-2-酮戊二酸的积累水平高于20mM。

下列产生(2S，4S)-4-羟基-L-谷氨酸的方法是已知的；一种是包括使谷氨酸脱氢酶在氨和NADPH存在时作用于化学合成的DL-4-羟基-2-酮戊二酸，并用离子交换层析分离最终的4(R)-和4S-4-羟基-谷氨酸的方法。一种是从植物中提取(2S，4S)-4-羟基-L-谷氨酸(Phlox decussata)[酶学方法，17部分B，277]的方法；和一种允许转氨酶同时作用于L-4-羟基-2-酮戊二酸和半胱氨酸亚磺酸[四面体通讯，28，1277(1987)]的方法。

本发明的发明人以前曾报道过产生(2S，4S)-4-羟基-L-谷氨酸的方法，该方法使(例如，提供)生物催化剂(其具有在氨基供体存在时由丙酮酸和水合乙醛酸产生(2S，4S)-4-羟基-L-谷氨酸的活性)作用于水合乙醛酸和丙酮酸或能转化为丙酮酸的化合物(日本未审查专利出版物No.8-80198)。该方法仅在产生4(S)形式时有工业优势；然而，该方法费力和劣势在于其需要进一步将(S)-4-羟基-L-酮基谷氨酸转变为(2S，4S)-4-羟基-L-谷氨酸，其通过在合成(S)-4-羟基-2-酮戊二酸的步骤后向(S)-4-羟基-2-酮戊二酸中加入另一种细菌，以便由此方法产生大量(2S，4S)-4-羟基-L-谷氨酸。

下列方法是已知的产生(2S，4S)-4-羟基-L-脯氨酸的常规方法；一种是通过培养卷角霉属或顶柱霉属的微生物以从培养菌中提取脯氨酸的方法(日本未审查专利出版物No.5-111388)；和一种使(例如，提供)微生物(其具有将4-羟基-2-酮戊二酸转变为4-羟基-L-脯氨酸的活性)作用于4-羟基-2-酮戊二酸的方法(日本未审查专利出版物No.3-266996)；及其类似方法。然而，这些方法的工业应用是困难的，因为前一种方法的产率低而后一种方法需要分离和纯化同时产生的4(S)和4(R)形式的耗费劳动的工序。

本发明的目的是提供一种有利于工业上产生(S)-4-羟基-2-酮戊二酸和由前体(S)-4-羟基-2-酮戊二酸制得的化合物的方法，所说的化合物例如(2S，4S)-4-羟基-L-谷氨酸和(2S，4S)-4-羟基-L-脯氨酸。

本发明涉及产生有旋光力的化合物的方法，该方法使(例如，提供)重组微生物(其携带包括编码(S)-4-羟基-2-酮戊二酸醛缩酶DNA片段(以下简写为″KAL基因″)的重组DNA)，在液体培养基中具有或缺乏氨基供体时作用于糖和水合乙醛酸，并收集在液体培养基中产生的有光学活性的(S)-4-羟基-2-酮戊二酸或由前体(S)-4-羟基-2-酮戊二酸产生的化合物(以下简写为″4(S)KHG″)。

图.1描述了质粒pKSR101及其限制性酶切图；

图.2描述了质粒pKSR601及其限制性酶切图；

图.3描述了质粒pKSR125的构建过程及该质粒的限制性酶切图；和

图.4描述了质粒pKSR50及其限制性酶切图。

本发明涉及产生(S)-4-羟基-2-酮戊二酸(4(S)KHG)的方法或产生可由前体4(S)KHG形成的化合物的方法。