[发明专利]粒细胞集落刺激因子的制备

说明书

本发明涉及多肽药物的制备，特别是涉及G-CSF的制备，具体地说是采用基因重组技术制备分泌型人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)的方法。该方法包括G-CSF基因工程菌的构建、菌体发酵培养、蛋白纯化等过程。采用该方法制备G-CSF，工艺简单、稳定，适于工业化生产，生产出的产品，其结构及生物活性与天然G-CSF完全一致。人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)是一种能够促进中性粒细胞增殖与分化，维持人体正常免疫功能的重要造血因子。早在70年代，人们发现体外组织细胞培养上清、器官提取物及某些能在体外长期生长的细胞系，能产生一些刺激白细胞前体增殖、分化形成集落的活性物质，并称之为集落刺激因子(Colony stimulating factor CSF)。1977年，人们首次从小鼠肺组织条件培养液中分离纯化出能够刺激粒细胞和巨噬细胞集落形成，分子量为单一成份的糖蛋白，并将其命名为GM-CSF(Burgess et al，1977.)1983年，Nicola等人又从经细胞内毒素刺激过的小鼠肺组织条件培养液中分离出一种能特异地刺激粒细胞集落形成的CSF，并命名为G-CSF(Nicola et al，1983)。1985年，Welte首次纯化出人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)(Welte etal，1985)，不久，Souza等人又克隆出其基因，并将其成功地在E.Coli中表达。E.Coli中表达的重组G-CSF分子虽不带多糖，却具有与天然G-CSF完全相同的体外生物学活性(Souza etal，1986)。80年代中期以来，随着G-CSF基因的克隆及其在体外表达的成功，人们得以对其分子结构及生物学功能进行广泛深入的研究，并于90年代初将其正式应用于临床，治疗包括化疗放疗所致中性粒细胞减少，骨髓移植，骨髓异常增生综合症(MDS)，再生障碍性贫血所致中性粒细胞减少，AIDS病等病症。G-CSF的发现与临床应用被称为本世纪药物研究的第三个里程碑。由于G-CSF具有巨大的临床应用价值，采用先进的基因工程技术进行生产，降低生产成本，提高产品质量显得十分重要。目前G-CSF在大肠杆菌中表达所采用的是包含体技术，它将G-CSF先在大肠杆菌中表达成不具生物活性的包含体，然后通过包含体复性过程，使之恢复成具有生物学活性的形态，这一过程耗时长，工艺复杂，收率低，产品N-末端比天然产物多一个蛋氨酸，其稳定性及生物学活性均不如天然产物。通过反复研究，我们发明了在大肠杆菌中分泌表达G-CSF的独特技术。这套技术工艺简单，回收率高，生产成本低，周期短，所得G-CSF与天然G-CSF具有完全一致的蛋白一级序列。它稳定性好，且具有与天然产物同等的生物学活性，解决了现有技术中存在的问题。本发明提供了一种以特殊的大肠杆菌菌系为载体的的表达用工程菌，这种工程菌具有如下特点：(1)它的部分蛋白酶基因被突变，因而使得某些易于被大肠杆菌降解的蛋白产物得以保护；(2)它的外膜较一般大肠杆菌更易破裂，因而纯化目标蛋白时，有利于目标蛋白从菌体中的释放。在表达质粒的构建方面，具有如下特点：(1)在目标蛋白基因前加入了大肠杆菌蛋白的分泌信号肽。这一信号肽在目标蛋白的翻译时可与目标蛋白形成融合蛋白，并可使目标蛋白从细胞内转运到细菌内外膜之间的细胞间质中，并在转运的过程中使细菌信号肽自动切除，最终在细胞间质中获得具有天然生物学活性和蛋白一级序列的目标蛋白。(2)采用一类启动子，这类启动子的强度应该是随着发酵的不断进行而逐步加强，这是因为分泌型最重要的特点是能够将目标蛋白正确地折叠成天然构象，而蛋白折叠过程需要一定的时间，因此细菌生长时应控制启动子启动速度，保证目标蛋白产生的速度与其折叠的速度能够相匹配。本发明还提供一种采用分泌型技术，并以上述表达工程菌为菌株生产G-CSF的方法。本方法的技术关键之一是控制较低的发酵温度，采用该技术可以提高发酵产量，也可使分泌速度减慢，使分泌出的蛋白都具有正确的构象和较高的生物学活性，同时也降低蛋白被降解的机率；本方法的技术关键之二是在蛋白提纯时，首先采用低温低渗的办法破坏细菌外膜(不破坏细菌内膜)，使分泌出的蛋白释放到缓冲液中，由于细胞膜未被破坏，故细菌体内的大量杂蛋白及DNA等都可以从一开始就与目标蛋白分离.此后，采用(NH₄)₂SO₄沉淀结合等电点沉淀的办法，能够去除大量杂蛋白，并使目标蛋白的纯度接近70％，量后，依次使用分子筛层析；阳离子交换柱层析；脱盐；阴离子交换柱层析的纯化办法，获得纯度＞99％的G-CSF。产品活性及稳定性达到天然G-CSF的水平。本发明的实施步骤如下：步骤一，表达质粒的构建1.G-CSF基因的克隆hG-CSFcDNA可以采用RT-PCR法制备。2.表达载体的构建根据表达载体克隆位点的要术，5’端和3’端PCR引物中分别设计相应的酶切位点，5’端引物在酶切位点后与G-CSF的cDNA起始核苷酸之间是一段细菌蛋白信号肽的寡聚核苷酸，引物设计时应注意顺序设计，最终应使得信号肽的最后一个密码子与G-CSF的N-F末端第一个氨基酸的密码子紧密连，翻译时能够行成一个信号肽与G-CSF的融合蛋白。在这一表达质粒中，应采用一类特殊启动子，这类启动子强度应该是随着发酵的不断进行而加强，这是因为分泌型最重要的特长是能够将目标蛋白正确地折叠成天然的构象，而蛋白折叠过程需要一定的时间，因此细菌生长时应控制启动子启动速度，保证目标蛋白产生的速度与其折叠的速度能相匹配。对T7，Lac及热敏启动子，它们一旦被启动，强度及即非常强，并迅速地产生大量目标蛋白，这些目标蛋白通常来不及正常折叠，因此，在这些体系中表达的蛋白大部分以包含体形式存在。步骤二、表达用工程菌的构建应选用一种适合于表达分泌型蛋白质的大肠杆菌K12系列菌种，这种菌种其外膜相对较为脆弱，易于在纯化时通过简单的物理化学处理将储存在外膜内的蛋白释放出来，而在此过程中其内膜又不应被破坏，对这些菌种应采用同源重组的办法除去一系列蛋白酶，以使得G-CSF在表达后不会被降解。步骤三，G-CSF工程菌的发酵1、发酵培养基发酵培养基应根据所选用的启动子不同而确定配方，如采用trp启动子时应选择含色氨酸较低的培养基，若采用phoA启动子，则应选择低磷培养基。2、发酵温度发酵培养温度的选择应同时考虑到目标蛋白在细胞间质中的稳定性，同时，又要兼顾培养时间和蛋白表达速度，在同样条件下，应使培养时间尽量缩短，以缩短目标蛋白暴露在细胞间质中的蛋白酶的时间，蛋白表达速度应使得表达速度、目标蛋白折叠速度及目标蛋白从内膜转运到细胞间质中的时间相互匹配，从而使得所有表达出的蛋白都能以正常的空间构象分泌到细胞间质中，以包含体形式存在的蛋白最少。3、溶氧条件溶氧是控制目标蛋白表达的关键环节之一，为使表达出的目标蛋白都尽可能多的分泌到细胞间质中，应尽可能使细菌保持充分的有氧代谢生长状况，因此，在分泌型表达时，维持尽可能大的DO2，充分满足细菌生产所需要的氧气是非常重要的。4、PH值不同的PH值对于G-CSF表达没有直接影响试验发现，在较低PH时，表达出的蛋白基本没有聚合，而在较高PH时，可见有少量蛋白聚合物，宜选择在不影响细菌生长的前提下以较低的PH作为培养的PH值。步骤四，蛋白纯化1，裂解菌体分泌型G-CSF主要分泌在大肠杆菌外膜与内膜之间的细胞间质中(periplasm，95％左右)，因此在裂解菌体时应考虑如何只破碎细胞外膜而不影响内膜，从而可以最大限度地提取出所有分泌出的G-CSF，而又不受细胞内杂蛋白(尤其是蛋白酶)及核酸的影响，实验证明，采用低渗冻融能有效地抽提出分泌出的G-CSF(收率＞90％)而又不影响细胞内膜。低渗溶液的PH可以是酸性或碱性，体积一般为菌体湿重量的7-8倍。2，盐析蛋白纯化起始时所考虑的办法通常是盐析，这样可以非常简单迅速地除去大量的杂蛋白，G-CSF是一种疏水性很强的蛋白质，对无机盐非常敏感，而这种敏感性又随不同的PH而有所不同。在盐析时，我们考虑到这一特殊因素采取了二步盐析的办法，分别采用不同种类的无机盐，并在不同PH下进行盐析，盐析后，沉淀中G-CSF的纯度可达到70％左右，并除去了大量的色素分子。3，精制纯品盐析后的G-CSF样品中，仍有不少杂质，主要为色素、杂蛋白、核酸及热源。在设计层析精纯时，可以选用不同的介质，以除去不同类型的杂质，同时也要考虑不同介质使用的先后次序，以便最大限度地提高层析的收率，减少中间步骤。经过反复实验，我们采用分子筛，阳离子交换树脂，阴离子交换树脂，脱盐等纯化方法。分子筛柱主要用于分离高分子量的杂蛋白及部分热源；离子交换树脂用于除去另一些杂蛋白、核酸，热源及残余的少许杂蛋白。这样的纯化组合，中间步骤少，纯化率高，收率可达35％左右，最后纯度可达99％，具有很高的工业生产价值。以下为实施例，本发明的实施例不应作为对本发明的限制