[发明专利]用于检测人免疫缺陷病毒-1型的引物

说明书

本发明涉及分子生物学和核酸化学领域。特别涉及检测人类免疫缺陷性病毒1型(HIV-1)的方法和试剂，因此本发明可用于一般医学领域，特别是医学诊断学领域和分子生物学领域。

扩增核酸特定序列方法的发明，即聚合酶链反应(PCR)，为快速检测样品中存在的过去曾认为是不可检测的微量核酸提供了可能(见美国专利4,683,195、4,683,202、4,965,188)。PCR技术的发展和应用在文献中有详细报道，例如关于PCR相关课题范围的资料可见于“PCR技术-DNA扩增原理和应用”，1989，(HA.Erlich编)Stockton Press，New York，NY；“PCR手册：方法和应用指南”，1990，(M.A.Innis等编)Academic Press，San Diego，CA；以及PCR技术，1995，(M.A.Innis等编)Academic Press，San Diego，CA。由销售商，例如Perkin Elmer(Norwalk，CT)，出售PCR试剂并出版PCR技术手册。

应用PCR和探针杂交技术扩增并检测HIV-1核酸的报道见于Kwok，1992，医学年鉴(Ann.Med.)24：211-214；及Coutlee等，1991，分子细胞学探针(Mo1.cell.Probes)5：241-259。以PCR技术为基础的HIV-1检测鉴定方法见于美国专利号5,008,182.和5,176,775；Kellogg and Kwok，1990，PCR手册-方法和应用指南(Innis等编)，Academic Press，San Diego，CA：337-347，Holodniy，1991，传染病杂志(J.Inf.Dis.)163：802-865；Jackson，1991，艾滋病5：1463-1467；Mulder，1994，临床微生物学杂志(J.Clin.Microbiol.)32(2)292-300。

用于扩增和检测HIV-1的商品试剂盒可以从Hoffmann-LaRoche(Nutley，NJ)购得，Amplicor^TMHIV-1实验是检测HIV-1原病毒DNA的体外实验方法，AMPLICOR HIV-1 MONITOR^TM实验是HIV-1 RNA定量的体外实验方法。两种Amplicor实验都使用SK462(SEQ ID NO：5)和SK4321(SEQ ID NO：6)引物扩增HIV-1核酸，在Mulder等，1994，临床微生物学杂志(J.Clin.Microbiol)，32(2)：292-300中有叙述，本文特称为Amplicor HIV-1引物。

HIV-1具有相当的基因组序列多变性。对HIV-lgag及eiv基因核酸序列的多基因分析见Myers等，1993，人类反转录病毒和艾滋病1993，Los AlamosNational Laboratory，Los Alamos，NM.已明确M族存在A-J亚型。

现有技术中的分子生物和核酸生化的传统技术，可见有关文献的解释，例如，Sambook 1989，分子克隆-实验手册，(Molecular Cloning-A LaboratoryManual)Cold Spring Harbor，New York；寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)(M.J.Gait，1984)；核酸杂交(Nucleic Acid Hybridization)(B.D.Hames andS.J.Higgins.编，1984)；以及丛书，酶学方法(Academic Press，Inc.).

已鉴定明确了许多HIV-1 M族分离物(毒株)应用上述gag基因扩增引物，特别是Amplicor HIV-1引物SK462(SEQ ID NO：5)及SK431(SEQ IDNO：6)，是不可扩增或者是不可有效扩增的。这些毒株以前在AmplicorHIV-1引物结合区中未见序列变化。

本发明的目的之一是提供改进的一些引物，能有效扩增这些新发现毒株以及应用这些Amplicor HIV-1引物扩增所有的毒株。而且本发明的引物能以近似相同的效率扩增所有已知的HIV-1型M族毒株。

本发明涉及改进的寡核苷酸引物，该引物能使HIV-1型M族A-G亚型的gag基因片段的PCR扩增具近似相同效率而不出现非目的片段的伴随扩增。