[发明专利]修饰的引物

说明书

本发明涉及分子生物学和核酸化学领域，特别涉及提高核酸扩增反应产量的方法和试剂。因此本发明可应用于任何有关核酸扩增的领域。

聚合酶链反应(PCR)的发明使在体外扩增核酸序列成为可能，有关PCR的资料可见美国专利号4，683，195；4，683，202；和4，965，188；Saiki等，1985，科学(Science)230：1350-1354；Mullis等，1986，Cold SpringsHarbor，Symp．Quant．Biol．51：263-273；以及Mullis和Faloona，1987，酶学方法(Methods Enzymol)，155：335-350。PCR技术的发展和应用已广泛见于本学科文献，例如，PCR相关课题范围见于PCR技术-DNA扩增原理和应用，1989，(H．A．Erlich编)stockton press，New York；PCR方案：方法和应用指南，1990，(M．A．Znnis等编)，Academic press，San Diego；以及PCR策略，1995，(M．A．Znnis等编)，Academic press，San Diego；销售商例如PerkinElmer(Norwalk，CT)，出售PCR反映试剂并出版PCR手册。

自从最初核酸扩增方法公布以来，各种以引物为基础的核酸扩增方法包括(但并不仅限于这些)连接酶链反应(LCR，Wuand Wallace，1989，基因学(Genomics)4：560-569；Barany，1991，美国国家科学院院刊(Proc．Natl．Acad．Sci．USA)88：189-193)；聚合酶、连接酶链反应(Barany，1991，PCR方法和应用、1：5-16)；间隙连接酶链反应(PCT专利申请公布号WO90／01069)，修复链反应(欧洲专利申请公布号439，182A2)，3SR(kwoh等，1989，美国国家科学院院刊(Proc．Natl．Acad．Sci．USA)86：1173-1177；Guatelli等，1990，美国国家科学院院刊USA87：1874-1878；PCT专利申请公布号WO 92／0880A)。以及NASBA(美国专利号5，132，238)；Abramson和Myers，在1993当前生物技术(Current Opinon in Biotechnology)4；41-47中概括了各种扩增体系。

以引物为基础的扩增反应特异性依赖于引物杂交的特异性，在高于常规扩增的温度下，引物只与延伸的目的序列杂交。但扩增反应混合物通常在室温下制备，因此会降低引物杂交特异性所需要的温度，在非严谨条件下，引物可能会非特异性的与只有部分互补的核酸序列结合，或与其他引物结合，并引发非目的延伸产物的合成而伴随目的序列扩增。非特异引物延伸产物的扩增可与目的序列扩增竞争并显著降低所需序列的扩增效率。

常见的一种非特异扩增产物类型是模板非依赖性扩增反应的人工产物，称之为“引物二聚体”。引物二聚体是一双链片段，长度通常接近于两个引物长度的总和，一般发生于一个引物在另一个引物之上延伸时，产生的多联体可作为非目的模板，由于该模板长度比较短，因此能有效扩增。

可以通过在反应开始前减少引物延伸产物的形成来降低非特异扩增。在一种称为热起动法的方案中，从反应混合物中去除一种或多种反应物直到温度升至足以产生特异杂交时。在该方法中，反应混合物在反应条件不能保证特异引物杂交期间不支持引物延伸。

在手工热起动方法中，由于反应管在最初的高温孵育后是打开的，以便加入缺失的反应物，因此工作强度大而且增加反应混合物污染的危险。但可以用热敏感物质(例如，石蜡)隔离反应成分。见美国专利号5，411，876及Chou等，1992，核酸研究(Nud．Acids．Res．)20(7)：1717-1723。该方法中反应前的高温孵育可以融化热敏感物质，从而使反应物得以混合。

另一种在反应开始前降低引物延伸产物形成的方法是依据DNA聚合酶特异抗体对DNA聚合酶的热可逆性阻滞作用，见美国专利号5，338，671。在制备反应混合物之前将抗体和DNA聚合酶在缓冲液中室温下孵育，以形成抗体-DNA聚合酶复合物。抗体对DNA聚合酶活性的阻止作用可被反应前孵育时的高温失活。该方法的一个缺点是DNA聚合酶特异抗体的生产昂贵而费时，特别是大剂量应用时。而且反应混合物中抗体的加入要求重新设计扩增反应。

反应开始前延伸产物的形成也可通过加入一种单链结合蛋白来抑制，该蛋白以热可逆方式与引物非共价结合并防止杂交从而阻滞引物延伸。