[发明专利]同步检测鸡四种病毒试剂盒的制备方法

说明书

本发明涉及一种同步检测鸡新城疫(ND)、传染性法氏囊(IBD)、传染性支气管炎(IB)和产蛋下降综合症(EDS)四种病毒的条形酶标斑点试剂盒的制备方法。

ND、IBD、IB和EDS是鸡的四种最常见的传染病，也是造成养禽业巨大损失的主要原因。因此，对鸡群采取准确而快速的疫病监测是防止和减少由此而造成巨大经济损失的重要手段。酶联免疫吸附试验(ELISA)是当前应用最广、发展最快的一项新技术，其基本过程是将抗原(或抗体)，吸附于固相载体，在载体上进行免疫酶反应，底物显色后用肉眼或分光光度计判定结果。若以硝酸纤维膜为固相载体，待检样本点加在膜上，然后在膜上进行ELISA，则该法又称酶标斑点法(Dot-ELISA)。1994年第三期《中国畜禽传染病》(总第76期)刊登的《用Dot-ELISA检测传染性法氏囊病病毒》一文对此检测病毒法曾有报导。但此法即在一张硝酸纤维膜上吸附一种抗体，配以相应的试剂，用于检测一种病毒。由于在实际工作中，所检测的病毒很少是单一的，尤其是对鸡群进行ND、IBD、IB和EDS四种病毒的同步监测，此种单项检测的形式不仅操作起来比较烦琐，而且根本无法通过一次检测同时确定检样中是否含有四种病毒的任一种。由此，长期以来给禽病的监测工作带来诸多的不便，难以适应实际应用的需要。

本发明的目的在于克服上述现有技术之不足，提供一种能够快速、简便而又可靠的一次性同步检测鸡四种病毒条形酶标斑点试剂盒的制备方法。

本发明的目的是这样实现的：取经过纯化的NDV、IBDV、IBV和EDS的四种抗体分别用pH9.6碳酸盐缓冲液稀释，分别滴加在同一条形载体上的四个区域内进行包被。将包被后的载体自然干燥后，用封闭液将四个带状区域加以封闭，密封于塑料袋中，置于温度在4℃的环境中存放。包被好的载体配以相应的试剂：四种酶标记抗体、底物液、样品稀释液、洗涤液和终止液，即可用于对检测样品进行检测。

本发明的特点：将NDV、IBDV、IBV和EDS四种抗体包被在同一条形硝酸纤维膜上，配以相应试剂，即可对鸡群通过一次取样便可同时检测出是否有上述四种病毒的任一种，从而减少了由传统的一纸一法需多次重复操作和由此及因多种不同试剂造成的系统误差，并且具有操作方法简便、快速、灵敏、可靠及经济等显著的特点，是一项值得推广的技术。

实施例

步骤一以NDV、IBDV、IBV和EDS标准毒株按常规法分别接种鸡体获得相应的四种抗血清，然后将此四种抗血清分别经亲和层析进行提纯，并采用Folin酚试剂测定四种抗体的蛋白含量。

步骤二分别取NDV、IBDV、IBV和EDS四种纯化抗体，采用过碘酸钠法，以辣根过氧化物酶(HRP)标记制成酶标记抗体。

步骤三分别取经过纯化的NDV、IBDV、IBV和EDS抗体，用pH9.6碳酸盐缓冲液稀释为1～5μg蛋白质/ml的包被液；将四种抗体的包被液分别滴加在同一条形硝酸纤维膜(0.8×4.0cm)的四个区域内进行包被。每种抗体试剂5μl，在四个区域内均形成0.2×0.5的带状。自然干燥后用封闭液将四个带状区域加以封闭，然后密封于塑料袋中，置4℃保存。包被好的硝酸纤维膜配以相应的试剂：四种酶标记抗体、底物液、样品稀释液、洗涤液、终止液，即可用于对待检测样品的检测。

步骤四检测时，取一包被硝酸纤维膜，将待检样品(病料)剪碎，用样品稀释液作1∶5稀释后，滴加于包被硝酸纤维膜上，每个带状区域滴加5μl,30分钟后，用洗涤液冲洗3次。再滴加混合酶标记抗体，每个带状区域50μl,45分钟后，用洗涤液冲洗3次，最后滴加底物液(邻苯二胺-OPD)50μl,30分钟后，加终止液(IN硫酸)各50μl，终止反应，取出判读结果。若吸附某病毒的带状区域呈现棕褐色则检验结果为阳性，即检样中含有某种病毒。

附：操作与判读示意图

注：A、B、C、D分别表示NDV、IBDV、IBV、EDS抗体