[发明专利]抑制乙型肝炎病毒复制的反义脱氧寡核苷酸

说明书

本发明涉及抑制乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，HBV)DNA复制及乙型肝炎病毒基因的表达的反义脱氧寡核苷酸，它还可通过3’单磷酸化修饰以提高稳定性，从而提高对HBV的抑制效果。

乙型肝炎病毒(HBV)引起的乙型肝炎是一种严重的传染病。根据世界卫生组织(1988年)估计，全球的HBV携带者大约2-3亿人，主要分布在东南亚及非洲，全世界的所有肝细胞癌(Hepatocellular Carcmoma，HCC)患者中，有80％是HBV感染者，受HBV慢性感染的人群患HCC的相对危险性至少增加100倍。我国是乙型肝炎高流行区，8-10％的人群(约1亿人口)为乙型肝炎(病毒)表面抗原(Hepatitis B(virus)Surface Antigen，HBsAg)的阳性者。根据1980年全国调查，我国现患肝炎的病人约2千万，其中60％以上为慢性肝炎患者，由此可见，由HBV感染引起的乙型肝炎与其相关的HCC是世界性的主要健康问题之一。但是，到目前为止，临床上仍缺乏有效的直接抑制病毒繁殖的治疗方法。因此，研究新的治疗方法是当今一项紧迫的任务。

HBV是一种嗜肝性DNA病毒，具有很强的宿主特异性，其感染可引起急性或慢性肝炎。HBV的感染、繁殖依赖其DNA的复制及基因组的转录和表达。HBV基因组是一个部分双链环状DNA分子，约3.2kb，它含有4个主要的读码框架，它们分别编码核心抗原(preC，C)，聚合酶(P)，表面抗原(preS1，preS2和S)和X蛋白(X)。控制这些基因表达的顺式调控元件有启动子Cp，Sp1，Sp2和Xp，增强子ENI和ENII，静止子(silencer)和糖皮质激素应答元件GRE等。在它们的调控下，转录产生相应的mRNA：3.5kb，2.4kb，2.1kb和0.8kb mRNA(如图1所示)。起始位点不同的3.5kb mRNA具有不同的功能。较长的前核心mRNA翻译产生前核心抗原，然后加工成e抗原(HBeAg)；而较短的前基因组mRNA翻译产生C蛋白和P蛋白，同时也是HBV DNA复制的模板，通过逆转录产生子代DNA(李载平，汪垣：HBV分子生物学：前进中的生物化学论文集(二)，上海科学技术出版社，1992年，247-256)。

HBV病毒的复制过程已经研究清楚(参见Robinson WS，Klote L，and AokiN.，J.Med.Virol.，1990，31：18-32)，包括：

1，3.5kb的前基因RNA被包装进新合成的衣壳内，成为反转录的模板。衣壳包装的识别位点为ε。

2，在聚合酶的作用下反转录产生负链DNA。引物为聚合酶的N端，结合在3’端的DRI处。形成DNA：RNA杂合双链，然后由聚合酶中的RNase H水解杂合链中的RNA，留下DNA单链。

3，以负链DNA为模板，在3’端的DRII处向DRI合成一段DNA，再从5’端的DRI处合成正链DNA。合成过程中同时被包装运出细胞，出细胞后正链DNA的合成停止，其结果是部分双链部分单链的DNA分子。

可见，HBV复制过程中重要的元件包括直接重复序列DRI，DRII和衣壳包装的识别位点ε。DRI，DRII是正负DNA链合成的起点。前基因RNA中ε序列可以形成高级结构，是形成衣壳蛋白的识别信号。HBV DNA复制时的聚合酶是P蛋白。P蛋白由3.5kb mRNA从不同翻译起始点翻译而成，是一个95KD的富含组氨酸的碱性蛋白，可被加工成为多种分子量较小的产物。现已阐明P蛋白的4个功能结构域依次为：①蛋白引物[也称为引发酶(primase)或末端蛋白(terminal protein，TP)](可作为病毒DNA合成的引物，并与新生DNA共价连接[Wang G.H.，Seeger C.Cell 1992，71(4)：663-670])；②间隔区(删除大部分以后并不影响逆转录酶的活性)；③逆转录酶；④RNA酶H(RNaseH)。

抑制HBV病毒DNA的复制，减少病毒的数量，可达到抑制HBV基因表达，最终清除病毒的目的。