[发明专利]一种在植物中表达抗微生物的阳离子多肽技术

说明书

本发明属生物技术领域。具体地讲，本发明涉及抗微生物阳离子多肽(cationic peptide)及其表达载体和起动子，在植物中的转染和表达，转基因植物的选择和再生，转基因植物对其细菌与真菌性病原菌的抗性。

经济植物病原细菌和真菌导致数千万元的损失。在发展中国家约有40％的作物减产直接与植物病原细菌和真菌有关。植物基因工程技术使外原抗病基因能整合进植物基因组中。转基因的技术已在某些抗虫和抗病植物中取得了成功。但是在已有的转基因植物中，其抗病性是很有限的，缺乏广谱性。表达抗微生物的阳离子多肽可以引入广谱抗病性基因进植物中，增加植物对细菌的抗性。

阳离子多肽来自于昆虫，脊椎和无脊椎动物及植物中。根据其结构，分为α-螺旋，β-折叠及同时具α螺旋和β折叠等几大类。这些多肽具有广谱的微生物活性，可以抗格兰氏阳性和阴性细菌、寄生虫，甚至病毒。通过计算机模拟进行结构修饰及不同阳离子多肽的杂交，可以创造比天然更有活力的阳离子多肽。表达这些多肽在植物不仅可以提高植物的抗性，同时尝试用植物作为工厂，生产新一代抗微生物的阳离子多肽类抗生素。

本发明目的是:

(1)在植物中表达几种特殊的阳离子多肽，增强植物对细菌性和真菌性病害的抗性；

(2)利用植物作为工厂，生产新一代抗生素；

(3)转基因的中草药植物中表达抗菌肽，以提高中草药产量，改进和提高中草药的药性。

    发明的实施方案：

本发明提供了抗微生物的多肽基因及其在特别的表达载体上的克隆位置。一般来讲，这些载体系包含阳离子多肽的基因或以它们的前体形式扦入到各种起动子控制的植物表达载体上。将这些载体上的目的基因通过农杆菌或基因枪转入植物中，转基因的植物首先在愈伤组织阶段，通过体外抗病选择，然后再生成植株，再直接体内检测整株植物对植物病原性细菌或真菌的抗性。最后，植物生长成熟，收获整株植物或部份植物如块茎、块根等。

    抗微生物多肽基因的选择

我们选择了3种抗微生物的阳离子多肽及一种阳离子多肽的前体形式，如下表所示：

a.CEMA顺序为：

KWKLFKKIGIGAVLKVLTTGLPALKLTK

b.Pro-CEMA其Pro顺序为：

EPLQARAEVAAAPEQIAADIPEVVVSLAWDESLAPKHPGSRKN

c.Dermaseptin B：

AMWKDVLKKIGTVALHAGKAALGAVADTISQ

d.Temporin A：

FLPLIGRVLSGIL

    植物表达载体的构建

如下列描述所示，含抗微生物的基因的植物表达栽体的构建：

(1)pSAI4：

去掉PBI121上的CaMV 35S起动子和β-glucuronidase，插入HindIII-EcoRI DNA片段。该片段含2×35S起动子，一个AMV RNA4翻译增强子，CEMA基因和NOS-ter顺序，插入并克隆于pBI121中。

(2)pRSPC4，pSSPC4，pPINC4：

0.65kb起动子片段从pSAI4中去掉，插入HindIII-Xbal片段。这些HindIII-Xbal片段是分别来自于pRSP221(根特异性表达的起动子)，pSSP221(种子特异性表达起动子)和pRT210(伤愈应急反应的起动子)。

(3)pDPC121和pDPC221：

前者含pro-CEMA基因顺序，在pBI121载体上，具2×35S起动子，用于致癌农杆菌为中介转染的表达。后者含pro-CEMA DNA顺序在pBI121载体上，用于基因枪直接转导入植物细胞中。

(4)pD5B1217和pD5B2212，pTA1217，pTA2217：

用XbaI和SstI分别从pBI121和pBI221上去掉1.8Kb的Gus基因，扦入Dermaseptin B(DSB)gene顺序(pDSB1217，pDSB2212)或Temporin A基因顺序(pTA1217，pTA2217)。

(5)pDDSB1212：

Dermaseptin B基因构造在pBI121载体上，含有2×35S起动子和AMV RNA4增强子。

(6)pPDSB1217，pSDSB1212，pRTA1217：