[发明专利]底物的定量方法

说明书

本发明涉及能够迅速且容易地对血液、尿液和果汁等试样中所含的底物进行高精度定量的方法。

以往，作为不需要稀释和搅拌试液，就能够简便地对试液中的特定成分进行定量的方法有在电子传递体(又称为电子接受体)的存在下，使特定成分和以该特定成分为底物的氧化还原酶进行反应，使还原的电子传递体进行电化学氧化，由所得的氧化电流值进行定量的方法。

该方法一般使用日本专利公开公报平3-202764号揭示的生物传感器。

上述生物传感器是利用网版印刷等方法在绝缘性基板上形成由工作电极和对应电极组成的电极系，然后在该电极系上形成含有氧化还原酶和电子传递体的反应层，再在绝缘性基板上加上封盖和隔板而制得的。

上述生物传感器通过使用各种氧化还原酶，能够对各种特定成分进行定量。

作为生物传感器的一个例子，对葡萄糖传感器进行说明。

作为葡萄糖定量的方法，一般公知的是将葡萄糖氧化酶和氧电极或过氧化氢电极组合使用的方式(例如，铃木周一编《生物传感器》，讲谈社)。

葡萄糖氧化酶以反应系的氧为电子传递体，选择性地将作为底物的β-D-葡萄糖氧化为D-葡糖酸-δ-内酯。在该反应进行的同时，氧被还原为过氧化氢。用氧电极测定此时的氧消耗量，或通过使用了铂电极等的过氧化氢电极测定过氧化氢的生成量就可对葡萄糖进行定量。

但是，上述方法中，有的测定对象会受到溶解氧浓度的很大影响，而且，在没有氧的条件下就不能够进行测定。

所以，开发了不以氧为电子传递体，而是以铁氰化钾、二茂铁衍生物、醌类衍生物等有机化合物或金属配合物为电子传递体的新型葡萄糖传感器。

该类型的生物传感器可使已知量的葡萄糖氧化酶和电子传递体以稳定状态附载在电极上，使电极系和反应层以近乎干燥的状态合为一体。

由于这种生物传感器是一次性的，而且只要在插入于测定器的传感器触点中导入检体试样，就能够很容易地对底物浓度进行测定，所以，近年来倍受瞩目。

如上所述，使通过一连串酶反应而生成的电子传递体的还原体在电极上氧化，即可由所得的氧化电流值对试样中的底物进行定量。

使用工作电极和对应电极，以二电极方式测定氧化电流值时，对应电极上必须有被还原的电子传递体的氧化体。

底物浓度较低时，由于通过酶反应而被还原的氧化体的量较少，所以没有必要特别留意该电子传递体的氧化体的存在。

但是，底物浓度较高时，由于通过酶反应大部分电子传递体的氧化体转变为还原体，所以，对应电极上可还原的氧化体不足。其结果是，对应电极上的还原反应成为制约总反应速度的反应(限速反应)，从而对所得的电流测定值产生影响。

此外，试样中有时含有易氧化的物质，这些物质在电子传递体的还原体在电极上进行氧化的同时被氧化，生成氧化电流，使测定结果出现正的误差。而且，底物浓度较高时，氧化电流值的偏差较大。

本发明的目的是提供通过抑制对应电极上电子传递体的氧化体不足而引起的对电流值的影响，并减少易氧化的干扰物质引起的对电流值的影响，从而对较大浓度范围内，特别是高浓度范围内的底物进行高精度定量的方法。

本发明提供的底物的定量方法包括以下2个步骤：1.在电子传递体的氧化体的存在下，使试样中的底物和能与前述底物进行特异性反应的氧化还原酶反应；2.使步骤1中没有被还原的前述电子传递体的氧化体进行电化学还原，获得还原电流值。

易氧化的干扰物质包括血液中含有的抗坏血酸和尿酸等。由于这些易氧化的干扰物质难以被电化学还原，所以，不会产生还原电流。

因此，通过在一连串酶反应中没有被还原的电子传递体的氧化体的还原，由所得的还原电流值对底物进行定量的方法，能够减少易氧化的干扰物质的影响，以更高的精度进行定量。

以二电极式测定还原电流值时，在底物浓度较低的范围内，由于酶反应生成的电子传递体的还原体的量较少，所以，在电极上的氧化还原反应中，还原体的氧化反应成为制约总反应速度的反应(限速反应)，还原电流值随着底物浓度增加而增加。

由于电子传递体的氧化体随着底物浓度的增加而减少，所以，从某一底物浓度起氧化体变得不足。因此，在电极上的氧化还原反应中，电子传递体的氧化体的还原反应成为制约总反应速度的反应(限速反应)，还原电流值开始减少。

由于此时的还原电流值直接反映未在酶反应中被还原的电子传递体的氧化体的量，所以对底物浓度具有良好的应答特性。