[发明专利]含有钙调神经磷酸酶B亚基的药物组合物

说明书

本发明涉及含有钙调神经磷酸酶B亚基(CaNB)的药物组合物。

钙调神经磷酸酶(Calcineurin，CaN)是目前所知唯一依赖钙，钙调素(calmodulin，CaM)的蛋白磷酸酶。70年代末，80年代初首先在哺乳动物脑内发现并得到纯化。后来在人，兔的非神经组织乃至某些肿瘤细胞中均有发现。CaN的分子量是80KD，由催化亚基A(61KD)和调节亚基B(19KD)按1∶1组成。(Klee，C B et al.，The calmodulin regulated proteinphosphatase molecular aspects of cellular regulation，1988，Vol 5，p225)。

CaN A亚基是全酶催化和调节的核心。生物化学研究表明，它至少包含了4个结构域：与金属离子的结合区(或催化区)，与调节亚基B(CaNB)的结合区，与调节剂CaM的结合区及自抑制区。催化部位在A亚基上的最有力证据是：将A，B二亚基分离后，A亚基仍表现出蛋白磷酸酶的活性。CaN在蛋白磷酸酶分类中属丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶。命名为蛋白磷酸酶2B，其催化亚基A和此家族的其他成员特别是蛋白磷酸酶1，2A等有很高的同源性。这主要发生在它们的催化区域，因此它们的催化机制极其相似。但每种磷酸酶有着不同的调节区域和亚基，因而产生出结构和功能的差异。CaNA亚基与其他磷酸酶不同的是它的C末端多出170个氨基酸序列，此序列为B亚基结合区，CaM结合区和自抑制区，它们都与调节CaN磷酸酶的活性有关。

人的CaN B亚基由169个氨基酸组成，它是钙结合蛋白家族中的一员，其一级结构与CaM，肌钙蛋白C等非常相似，与CaM的序列有31％-35％的同源性。并也有4个EF手的钙结合区域。钙离子结合区的氨基酸序列有更为高度的保守性。CaN B亚基与CaM的空间结构也极其相似，都包括了两个球型的，分别含有2个结合钙的结构域和连接两个结构域的中心α螺旋。与CaM不同的是CaM的两个球型钙结构域位于中心α螺旋的两侧，而CaNB亚基的两个球型钙结构域通过中心螺旋在85位甘氨酸处发生急剧转变，连同C末端的β链形成了一个疏水凹槽。使这两个球型钙结构域覆盖在其上侧，而CaNA亚基的B亚基结合中心螺旋(BBH)中的疏水氨基酸就结合在这个疏水凹槽中，成为CaN A，B二亚基结合的结构基础。(Kissinger，CR et al.，Nature，1995，378；641；Griffith，JPet al.，Cell，1995，82：507)。另一个与CaM不同的是CaNB亚基N末端的甘氨酸上连接有一个十四碳的脂肪酰基团。B亚基不具有蛋白磷酸酶的活力，但对于维持CaN酶活性是高度专一的。虽然CaNB亚基和CaM对CaNA亚基的活性具有协同调节作用，但二者对酶活力的调节是不可互相代替的。目前所知最主要的一点是：B亚基通过降低催化亚基A对底物的Km来调节CaN的活性。(Perrino，BA et al.，J.Biol.Chem.，1996，270：340)。

CaN是保守蛋白，广泛分布在真核生物中。从人，大鼠，小鼠，猪，蛙，鱼，鸡等的脑匀浆中以及人，兔等的非神经组织中均检出了CaN。从果蝇胚囊粗提物中检出了B亚基，但没有检出A亚基。在海胆卵中发现了一种受CaM调节的蛋白磷酸酶，它与CaN有着相同的亚基组成，它的小亚基与CaN的B亚基有着相似的肽图谱，但它的大亚基肽图谱与CaNA亚基的肽图谱不同(Klee，CB et al.，Adv.Enzymol.，1987，61：149)。表明B亚基比A亚基更具保守性。

我们曾用小鼠CaN抗体检测人脑及其他肿瘤中的CaN，结果发现，在我们检测的一些肿瘤如人脑胶质瘤，脑膜瘤等中均有B亚基的存在，含量还相当可观。但A亚基很不明显。小鼠H22肝癌腹水中CaNA，B二亚基均能检测到，但B亚基量大于A亚基。(魏群等，生物化学杂志，1993，9：240)。CaN在肿瘤组织中的存在和作用还值得进一步研究和探讨。

从分子生物学研究来看，已经从人，大鼠，小鼠，兔脑等组织的基因文库中分离到几个CaN cDNA克隆，真核组织中CaNA有3种基因编码，分别命名为CaNAα，β，γ。其中Aα，Aβ分别定位在人类4号和10号(10q21-q22)染色体上，CaNB亚基高度保守，目前只发现一种CaNB基因，定位于人的2号染色体(2p16-p15)上。(Wang，MG et al.，Cytogenet.CellGenet.，1996，72：236)。