[发明专利]蛋白质生产方法

说明书

最近几年人们研究了将甲基营养酵母作为异源蛋白质的合适的表达系统。尤其是多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)已被描述成大量外源基因的容易操纵的宿主有机体(可参见综述Gelissen & Melber 1996以及Gregg & Madden 1988)。由于发现甲醇代谢中涉及的酶的启动子很强，所以它们通常被用于控制蛋白质的异源表达(见EP 0173378,EP 0299 108,EP 0183 071)。

已知用于培养这些有机体的碳源对启动子调节有巨大影响。Gelissen等(1994)描述了在靠甲醇生长期间，多形汉逊酵母中大量存在甲醇代谢的关键酶。还发现在甘油生长细胞中可检测到大量甲醇氧化酶(MOX)和甲酸脱氢酶(FMDH)这些酶，但如果将葡萄糖用作碳源就不存在这些酶(例如见EP 0 299 108)。基于这些信息，可总结出这些酶是由甲醇诱导的。在靠甘油生长期间，MOX和FMDH的表达可用启动子的脱阻抑解释。在多形汉逊酵母和克勒克酵母菌(Kloeckerasp.)2201的葡萄糖限制的恒化培养物中，FMDH只是在小于0.1h-1的生长速率下被很少量地产生(Egli等1980)。因此，迄今一直将非阻抑碳源用于由甲基营养酵母异源表达蛋白质。培养多形汉逊酵母用于按补料分批法生产多种药物蛋白质，该补料分批法或以应用甘油的单一碳源方式或以应用甘油另加甲醇的两种碳源方式(Gelissen & Melber1996)。Weydemann等(1995)更详细地描述了生产水蛭素的一般方法。Chen等(1996)描述了也应用甘油作为非阻抑碳源由巴斯德毕赤酵母菌株生产凝血调节蛋白的方法。

但是，由于甘油昂贵，所以该方法至今都不适于生产例如饲料酶或工业酶的低成本蛋白质。因此，本发明的一个目的是克服这些障碍并提供一种通过培养转化的或未转化的真核细胞而制备内源蛋白质或异源蛋白质的方法，该方法的特征在于将阻抑基质用作碳源，在加料阶段限制碳源而在整个培养期间没有连续的氧限制；或者这种方法，其中该蛋白质是酶，特别是饲料酶，例如肌醇六磷酸酶、纤维素酶、木聚糖酶，或者是工业酶，例如淀粉酶、蛋白酶、转化酶、脂肪酶、过氧化氢酶、纤维素酶、葡糖氧化酶、醇氧化酶、果胶酶、柚苷酶(naraginase)、胶原酶、过氧化物酶或支链淀粉酶；或者这种方法，其中该细胞是甲基营养细胞和/或用DNA序列转化了，该DNA序列包括甲醇代谢中涉及的酶的启动子，如甲酸脱氢酶(FMD或FMDH)启动子、甲醇氧化酶(MOX)启动子或二羟丙酮合酶(DAS或DHAS)启动子；或者这种方法，其中该细胞是甲基营养酵母，优选是汉逊酵母属(Hansenula)、毕赤酵母属(Pichia)、假丝酵母属(Candida)或球拟酵母属(Torulopsis)，例如多形汉逊酵母或巴斯德毕赤酵母；或者这种方法，其中阻抑基质占碳源的1-100％，优选40-100％或更优选90-100％或是唯一的碳源；或者这种方法，其中该基质是糖如单糖、二糖、寡糖或多糖，例如葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉、糖原、纤维素或右旋糖或者含糖的混合物，如糖蜜、葡萄糖浆或果糖糖浆；或者这种方法，它以多次补料分批的方式进行。此外，本文中这种方法的特征在于加料速率范围受限于微生物的代谢特性和生物反应器中特别是氧的传质性能。加料速率优选保持在允许生产的最小值和避免培养物中氧限制的最大值之间。

至于生产异源蛋白质的方法，已经用DNA序列或包括编码这种异源蛋白质(例如在本案中的肌醇六磷酸酶)的DNA序列的载体转化真核细胞。分子生物学领域中的技术人员熟悉制备这类转化的真核细胞的方法，例如参见本案例EP684313或欧洲专利申请No.97810175.6的具体实施例。

本发明上下文中的“培养”具有本领域技术人员熟悉的普通含义。具体培养条件将取决于应用的细胞和待生产的蛋白质及其表达系统。发酵生产蛋白质领域中的技术人员也熟悉这类条件。此外，应懂得就本发明的实施来说，在短的分批阶段即细胞的生长阶段中，可应用阻抑的或非阻抑的碳源，分别如葡萄糖或甘油。在补料分批阶段即所需蛋白质的生产阶段中，培养过程是按本发明提供的方式进行的。

此外，实施本发明的令人感兴趣的甲基营养酵母例如可得自EP173378，第37和38页。

图1表示加料阶段中应用甘油或葡萄糖作唯一碳源培养多形汉逊酵母的时间过程比较；

图2表示多次补料分批培养循环，加料溶液中葡萄糖比例递增；

其中：CDM表示细胞干质量。