[发明专利]一种抗真菌蛋白

说明书

本发明涉及一种蛋白质，特别是涉及一种新的来源于有毒植物豆薯种籽的抗真菌蛋白及其制备和应用。

本发明所述的蛋白可被定义为具有抗真菌的活性—抗木霉菌、黄霉菌、稻瘟菌等活性。

所有高等植物都受到多种真菌的侵害。真菌病害是造成农作物减产的最严重的一类病害，全世界已发现的240种水稻病中，真菌性病害占90％(《水稻生态学》，梁光商主编，农业出版社，北京1983，322)，它每年给世界农业生产造成数十亿美元的损失。传统的育种方法虽可得到抗病品种，但耗资大、费时长，用化学杀菌剂会引起抗药性。因此，用生物工程技术得到抗病新品种是人类一直在努力进行的课题，而寻找新的抗真菌蛋白将为抗真菌转基因工程提供重要的基础和信息，为农业生产开辟植物育种的新途径。

除了几丁质和β-1，3葡聚糖等具有抗真菌能力的物质被发现外，Logcmann(Logemann，J.et al.，Biotechnology 1992，10：305-308)，Woloshnk(Woloshuk C.P.et al.，Plant Cell，1991，3：619-628)，Vigers(Vigers，A.J.et al.，Mol.Plant-Microbe Inter.1991，4：315-323)等人在大麦、烟草、玉米等新种籽中发现了抗真菌蛋白。在萝卜、千穗谷、紫茉莉等的种籽中也发现了一类碱性小分子量蛋白也具有抗真菌活性。根据孙勇如的总结论文(《植物学报》，1997，39(1)：91-96)，我国至目前只在天麻(胡忠等，《云南植物研究》1980，10：373-380)和萌芽水稻种籽(陈章良等，《高技术通讯》1994，2：22-26)中发现抗真菌蛋白。前者可抑制小麦赤霉菌和木霉菌(抑菌量为50μg)，后者具有抗木霉菌活性的同时，也具有以抑制胰蛋白酶为主的活性(陈章良等，《植物学报》1997，39(6)：561-569)，其抑制木霉菌最低量为20μg。我们从有毒植物豆薯种籽中分离出三个组分，液相色谱证明其为蛋白(吴红京等，《色谱》1997，15(2)：153-155)。

本发明的目的在于从有毒植物豆薯种籽中分离纯化含有较强的抑制木霉菌、黄霉菌、稻瘟菌等活性的抗真菌蛋白。

本发明采用简化、温和的分离纯化方法，包括盐溶液粗提、S-SFF强阳离子交换层析、DEAE-纤维素阴离子交换过滤、CM-纤维素阳离子交换梯度洗脱和G-75凝胶过滤(或Sephacryl S200)，由此得到高纯度、高活性的豆薯种籽的抗真菌蛋白，暂命名为PE3。

豆薯蛋白PE3的分离纯化流程见附图3，具体操作如下：

[1]粗提：将豆薯种籽100克粉碎，匀浆，用含0.6～0.9％NaCl的pH6.8～7.2 5mM磷酸盐缓冲液浸泡，4℃过夜。

[2]预处理：粗提液用双层滤布去掉粗渣，用40～50％HAc调pH至3.5～4.0，在4℃下静置2小时，高速离心得上清液。

[3]上S-SFF柱洗脱：粗提液的上清液上S-SFF阳离子交换柱(预先用pH4.0～4.5，0.01M NaAc缓冲液平衡)，用同样缓冲液洗杂蛋白后，用含约1N NaCl的平衡液洗脱，收集洗脱峰。

[4]上DE-52柱：由[3]所得洗脱峰溶液，经蒸馏水透析48h后，上预先用平衡液平衡过的DE-52阴离子交换柱，收集穿过峰。

[5]上CM-52柱：由[4]所得穿过峰溶液上CM-52阳离子交换柱(先用5mM～10mM PB液，pH6.0～6.5平衡)。用平衡液洗去杂蛋白，再用含0～0.2MNaCl的同样PB液进行洗脱，收集洗脱峰C1(见附图1)。

[6]上G-75柱：将[5]所得C1峰溶液，经浓缩、透析后，上预先用平衡液平衡过的G-75柱，用平衡缓冲液洗脱，收集洗脱峰C1G(见附图2)。

[7]冻干：由[6]所得C1G峰溶液，经充分透析后，冷冻干燥得冻干粉即为豆薯蛋白PE3。

本发明从有毒植物种籽—豆薯种籽—中分离纯化出一种抗真菌蛋白PE3，其分子量为14KD(SDS-PAGE检测)，等电点PI≈7.5。抑菌实验表明它具有抗木霉菌、抗黄霉菌活性，其抑菌圈分别为1.2cm和1.0cm，抑菌最低量分别为6.25μg和12.5μg。其对稻瘟菌也有一定的抑制作用。后来在其CM-52柱洗脱组份中又发现两个组分PA2，PA3具有抗木霉菌活性，其分子量范围在20～50KD之间，此两组分抑菌圈分别为3.5cm和3.0cm，抑菌量估算为8.89μg和9.24μg。