[发明专利]Vero细胞乙型脑炎灭活疫苗及其制备方法

说明书

本发明涉及生物工程领域，具体地是涉及一种Vero细胞乙型脑炎灭活疫苗及其制备方法。

目前世界上大量生产的乙脑疫苗有两种，一种是以日本为代表的用感染乙脑病毒的小白鼠脑组织经过研磨、乳化、浓缩、超速离心制备的纯化乙脑疫苗，一种是中国生产的原代地鼠肾细胞培养的乙脑灭活疫苗和原代地鼠肾乙脑活疫苗，这些疫苗的细胞基质均来源于普通级动物，无法保证不携带外源因子。

鼠脑纯化乙脑疫苗是用脑组织制造的，而脑组织疫苗在历史上曾发生过严重的过敏反应，因而用脑组织制备的疫苗虽经纯化处理仍不免有此忧虑；其次鼠脑纯化乙脑疫苗的制备必须经过一只一只小白鼠的脑腔接种，一个一个感染鼠脑的收获，其操作过程繁琐，无法形成工业化生产规模，所以若制成大批量的均质疫苗，成本很高，价格昂贵，对于一些主要靠进口乙脑疫苗的国家，由于价格的原因，很难满足供应。

据美国CDC发起的一项调查研究表明鼠脑提纯乙脑灭活疫苗二针注射后的抗体阳转率(≥1∶8)77％，6～12个月加强一针后阳转率(1∶16)100％，但是副反应发生率较高，包括局部反应和全身反应达41％。丹麦和澳大利亚使用日本鼠脑提纯乙脑疫苗后也有发生严重过敏性反应的报导，在印度使用这种疫苗测定抗体反应，结果并不理想。

中国当前生产的地鼠肾乙脑灭活疫苗对于降低乙脑发病率确实起了明显作用，使乙脑发病率稳步下降。但是其血清中和抗体阳转率并不理想，在非流行区学龄儿童或流行区1岁内儿童的中和抗体阳转率只有60％左右，加强一针后达到90％左右，并且，疫苗注射后的副反应主要是过敏反应，虽然普遍来讲比较轻微而尚可接受，但据调查统计的结果，在北京市，其副反应发生率在几种儿童普遍接种的疫苗中位居第二，仅次于百白破。还有一种AS14-14-2株乙脑活疫苗，由于只需注射一针就有较好的血清抗体反应，而且生产工艺简单成本低廉，故受到了生产厂家和使用者的欢迎，但是仍不能排除原代地鼠肾细胞外源污染因子的可能，而且有研究表明乙脑活病毒接种免疫抑制动物皮下可引起病毒入脑繁殖，所以在活疫苗的推广应用中也需予以适当注意，安全之策可以采取1岁之内灭活疫苗初次免疫，之后用活疫苗加强的办法。

中国生产的地鼠肾细胞乙脑疫苗所用的生产毒种仍是用感染普通小白鼠脑制备的，虽经多年使用证明是安全有效的，但抗原含量较低，其脑组织不仅是过敏源之一，而且饲养管理动物和制备毒种及其使用等均较麻烦，其生产工艺也不利于控制外源因子的污染，更不适合大规模工业化生产。

为了制备更好的乙脑疫苗，从80年代开始有关于基因工程乙脑疫苗的研究报导，其载体多种多样，表达蛋白大多是E蛋白、PrM和NS1，经过实验室检定和诱生抗体反应均比较满意，但是经病毒攻击的保护试验均不及全病毒疫苗理想。

Vero细胞是日本学者1962年从非洲绿猴(cercopithecus aethiops monkey)肾建立的猴肾细胞系。其名称的由来是取自世界语中“绿”字的VERDE前两个字母和“肾”字前两个字母合在一起，但世界语中不允许VERE存在，而需以“O”结尾，故命名为“Vero”。其第93代被带到美国NIH的过敏与传染病研究所热带病毒研究室，第113代被提交给ATCC，编号为ATCC NO.CCL-81。

经过全面的研究鉴定，Vero细胞具有胞核学稳定，没有外源因子污染和致瘤性的优点，完全符合1987年WHO关于用于生物制品的传代细胞的规程要求，并已被WHO批准可用作疫苗生产的基质。于是，Vero细胞小儿麻痹灭活疫苗、小儿麻痹活疫苗、Vero细胞狂犬病疫苗相继在法国被研制出来并获批准生产，并且有关用Vero细胞制备人用疫苗的研究报告亦时有报道，但关于用Vero细胞制备乙型脑炎疫苗的研究还未见系统报道。

本发明的目的之一在于提供一种Vero细胞乙型脑炎灭活疫苗，该疫苗中不含鼠脑组织，纯度高，免疫效果好，使用安全性高。

本发明的目的之二在于研究提出一种Vero细胞乙型脑炎灭活疫苗的制备方法，以Vero细胞培养取代原来的地鼠肾细胞培养，以Vero细胞毒种取代目前的鼠脑组织毒种，并通过浓缩纯化，提高疫苗质量和使用效果，实现乙脑疫苗的大规模工业化生产。

本发明提供的Vero细胞乙型脑炎灭活疫苗，是指在Vero细胞上接种Vero细胞乙脑病毒毒种得到的纯化乙型脑炎灭活疫苗。

本发明提出的制备方法包括以下步骤：

(1)、Vero细胞的培养扩增；

(2)、在Vero细胞上接种Vero细胞乙脑病毒毒种；

(3)、收获病毒；