[发明专利]用于重组腺伴随病毒生产的全功能辅助病毒的产生及其用途

说明书

本发明属于病霉基因工程领域，具体涉及大量生产重组腺伴随病毒(rAAV)所需的复制和包装功能系统。本发明涉及一种装载了2型腺伴随病毒(AAV-2)rep-cap基因(4.3kb)的重组单纯疱疹病毒(HSV1-rc)的产生方法及其在重组腺伴随病毒(rAAV)生产中的用途。这种重组单纯疱疹病毒能提供rAAV质粒在细胞内复制和包装成rAAV毒粒所需的全部辅助功能，并能用于rAAV的大量制备。HSV1-rc的产生是在对一套含有HSV1病毒全基因组的粘性质粒(Set C粘粒，包括cos6，cos14，cos28，cos48，cos56)进行改造的基础上实现的。用HSV1-rc感染rAAV载体质粒转染的细胞或稳定携带rAAV载体质粒的细胞株，就能产生大量有感染性的rAAV毒粒。用这种方法产生的rAAV能将外源基因导入哺乳动物细胞中并表达。

腺伴随病毒(adeno-associated virus，AAV)是微小病毒科(parvovirus)成员，其基因组为4682个核苷酸组成的单链DNA。AAV是依赖性病毒，需要其它病毒如腺病毒或单纯疱疹病毒，或辅助因素提供辅助功能才能复制。在没有辅助病毒存在时，AAV感染细胞后其基因组将整合到细胞染色体中成为潜伏状态，而不产生子代病毒。

AAV-2的全长基因组已克隆至大肠杆菌质粒中。其中含有2个各145bp长的倒转末端重复序列(Inverted terminal repeat，ITR)。它们是AAV基因组的复制起点，并与AAV复制、整合或包装等功能有关。其基因组其余部分可分为2个功能区，rep基因区和cap基因区。rep基因有4种不同的形式的产物：Rep78，Rep68，Rep52，Rep40。它们为AAV复制和病毒基因表达等所必需的调节蛋白。cap基因编码3种结构蛋白，VP1，VP2，VP3，共同组装成AAV病毒的外壳。rep和cap基因编码的蛋白在AAV产毒性复制中都是反式作用蛋白。

AAV被认为是基因治疗理想的候选载体之一。许多实验室都构建了能将外源基因导入细胞的rAAV病毒。AAV载体质粒的主要结构特征是将rep-cap基因从病毒基因组中切除，代之以所需的DNA片段。

产生rAAV病毒的经典方法为将rAAV载体质粒与含有rep-cap基因的辅助质粒导入腺病毒或单纯疱疹病毒感染的细胞中。2-3天后从培养上清及病变的细胞中即可收获到rAAV病毒，同时还含有所用的腺病毒或单纯疱疹病毒。腺病毒和单纯疱疹病毒都可用热处理(55℃30分钟至2小时)而灭活，但不影响AAV病毒的活性。

虽然这种生产rAAV病毒的方法比较简单，但仍存在许多明显的缺点。首先，每次制备rAAV病毒时都需要转染细胞。由于转染方法自身的限制，转染及共转染效率较低，是产生rAAV病毒滴度较低的原因之一。而且，用转染方法目前还难以大规模转导细胞，因此不适应大量生产rAAV病毒的需要。因此，有必要研究一种能用于大量生产rAAV病毒的系统和方法。

颜子颖等1996年曾申请名为“能用于包装重组腺病毒伴随病毒的单纯疱疹病毒载体及其用途”的发明专利(中国专利申请号96 120549.0，公开号CN 1159480A)。该专利介绍了一种将AAV-2 rep-cap基因置于HSV1扩增子载体质粒，构建成pHSV-AAV(+/-)。将该质粒导入细胞中，在HSV-1野生型病毒的存在下，可获得一种野生型HSV-1和含rep-cap基因的假病毒的混合病毒，该混合病毒具有提供rAAV病毒复制和包装的全部辅助功能。最近Conway等(Conway JE et al，Recombinant adeno-associated virus type 2 replication and packaging isentirely supported by a herpes simplex virus type 1 amplicon expressing rep and cap JVirol.71(11)：8780-8789，1997)也报道了类似的研究。但是，这种混合病毒中假病毒所占的比例较小(＜10％)，所能提供的辅助功能有限：并且假病毒与野生型病毒的比例在病毒传代中不固定，不利于大量生产的质量控制。

本发明的目的在于提供用于简便而大量生产rAAV病毒的技术方法和全功能辅助病毒HSV-rc。本发明的目的是通过提供含有rep-cap基因的重组粘粒及其构建方法、HSV-rc病毒及其构建方法及用HSV-rc生产rAAV病毒的方法而实现的。