[发明专利]D－泛解酸和D－泛酸的生产

说明书

本发明涉及一种新的D-泛解酸和/或D-泛酸(或其盐)的生产方法和纯化方法，一种能够生产它的微生物，和一种具有包括在泛解酸或其盐或其部分区域的生物合成中的一种基因区的质粒DNA。泛酸是一种有用的维生素物质。D-泛解酸是用作合成泛酸和CoA的重要中间体物质。

通常D-泛酸(或其盐)即一种重要的维生素物质的生产方法包括：(1)通过DL-泛酸内酯(pantolactone)的光分解获得D-泛酸内酯和β-丙氨酸(或其盐)在甲醇中化学缩合的方法，(2)D-泛酸酯水解成D-泛酸的方法，D-构型的DL-泛酸酯选择性水解成D-泛酸的方法，这两种方法均使用微生物或一种酶(未审公开的日本专利Nos.228487/1989和228488/1989)，(3)使泛解酸钾、β-丙氨酸和ATP与在Tris缓冲液中的休眠细胞或微生物酶接触得到泛酸的方法(描述于Journal of Biological Chemistry，第198卷，第23页(1952)，发表于第176届American Chemical Society National Meeting的Abstractsof Papers，Division of Microbial and BiochemicalTechnology，No.48(1978)和其它公开出版物)。

通常D-泛解酸和/或D-泛酸内酯的生产方法包括(4)将一种分解剂例如奎宁或番木鳖碱用于光分解的方法，(5)用一种特定的微生物使DL-泛酸内酯中的L-泛酸内酯分解，得到单一的D-泛酸内酯的一种方法(审定公开的日本专利No.19745/1972)，(6)用一种特定的微生物使DL-泛酸内酯中单一的L-泛酸内酯氧化得到酮泛酸内酯(ketopantolactone)，然后使它不对称地还原成D-泛酸内酯的方法(审定公开的日本专利No.293386/1986)，(7)将化学合成酮泛酸内酯用一种特定的微生物不对称地还原成D-泛酸内酯的方法(审定公开的日本专利No.14797/1986)，(8)用一种特定的微生物使DL-泛酸内酯中的L-构型不对称的水解成L-泛解酸的方法(未审查公开的日本专利Nos.152895/1982和294092/1987)以及(9)用一种特定的微生物使DL-泛酸内酯中的D-构型选择性不对称水解成D-泛解酸的方法(审定公开的日本专利No.65198/1991)。

人们关心怎样收集泛酸的盐，一种公知方法是在结晶前加入氯化钙，以得到高产率和高纯度的泛酸钙和氯化钙的络合盐结晶(如Jonathan O.Brooks 1960年10月18日申请的US2957025，审定公开的日本专利No.49571/1972等所述)。然而，没有一种方法能从这样获得的络合盐中去除氯化钙以高产率获得泛酸钙，该络合盐是通常所述的成品。

在工业化生产D-泛酸(包括其盐；以下应用相同)中，方法(1)不仅需要复杂的工艺以合成原料DL-泛酸内酯，而且需要一种麻烦且困难的方法进行其光分解。方法(2)缺点是需要由DL-泛酸内酯生产D-泛酸酯或DL-泛酸酯的方法。方法(3)的缺点在于需要使用昂贵的ATP和Tris缓冲液；泛酸的产率仅为痕量，且当使用昂贵的D-泛解酸(或其盐)作为原料时是不实用的。

还有，D-泛解酸和/或D-泛酸内酯的大部分生产方法的失败在于它们使用DL-泛酸内酯作为原料，它需用麻烦的合成工艺。然而，方法(4)的缺点为，例如使用一种昂贵的分解剂和D-泛酸内酯回收困难，以及方法(5)具有所生产的DL-泛酸内酯丢失一半的缺陷。在方法(6)、(7)、(8)和(9)中，由于所用微生物的性质，或由于泛酸内酯(或泛解酸)的性质，在培养肉汤中生产100％光学纯的单一的D-构型是非常困难的。方法(4)、(8)、和(9)也涉及更多麻烦的工艺因为要回收、消旋和重新利用残余的L-构型。

通过对于D-泛酸的有利于工业化和更有效的生产方法的广泛研究，本发明人发现在添加β-丙氨酸的培养液中培养一种微生物会导致D-泛酸的形成。本发明人也发现D-泛解酸能通过培养耐水杨酸的菌株进行积累，通过在添加β-丙氨酸的培养液中培养耐水杨酸的菌株可生产高浓度的D-泛酸，并且使用能耐α-酮异戊酸、α-氧代丁酸、α-氨基丁酸、β-羟基天冬氨酸和/或O-甲基苏氨酸的菌株会增加D-泛解酸和D-泛酸的产量。同时，本发明人通过研究应用基因重组技术进行菌株繁殖，发现用包括泛酸或其盐生物合成运载基因的一种质粒转化的菌株在培养液中以甚至更高的浓度积累D-泛酸或D-泛解酸(和/或D-泛酸内酯)。基于这些发现本发明人作进一步研究，并发展成本发明。