[发明专利]哺乳动物心肌中提取酸性成纤维细胞生长因子样物质的方法

说明书

本发明涉及一种从哺乳动物心肌中提取酸性成纤维细胞生长因子样物质的方法。

成纤维细胞生长因子(fibroblastgrowthfactor)(以下简称FGF)，是一组首先从牛脑垂体中发现的、在动物机体内分布十分广泛的、且具有多种生物学功能的多肽生长因子。到目前为止，已经发现的FGF样物质共有9种，其中最主要的、研究最多的是酸性成纤维细胞生长因子(acidicfibroblastgrowthfactor)(以下简称aFGF)和碱性成纤维细胞生长因子(basicfibroblastgrowthfactor)(以下简称bFGF)，它们对中胚层和神经外胚层来源的细胞具有广泛的促增殖作用，可直接参与创伤愈合和血管新生、神经生长及胚胎发育等重要过程。

aFGF是由140个氨基酸组成，基因定位在第4对染色体上，等电点为5.6，其氨基酸序列与bFGF有55％同源性。aFGF主要分布在动物的脑、心脏和视网膜，在这三个部位的含量约为bFGF的100倍以上。aFGF的获得主要是通过生化提取的方法。近年来，随着分子生物学技术的发展，通过基因工程的方法可以得到大量的高纯度的重组的酸性成纤维细胞生长因子，但由于细菌和酵母合成的酸性成纤维细胞生长因子与真核细胞内所表达的酸性成纤维细胞生长因子在折叠方式上的差异，使得重组的酸性成纤维细胞生长因子完全没有生物活性。因此，在基因工程技术尚未完美和普及的今天，采用生物化学的方法从组织中分离纯化出具有较高生物活性的酸性成纤维细胞生长因子，对研究该蛋白质的生物学特性、生理作用及临床上用于创伤愈合、组织修复和再生、促进血管生长和神经营养等治疗具有重要意义。

以往主要从牛脑中提取酸性成纤维细胞生长因子，但牛脑体积小、每只牛脑的重量约300克，约含酸性成纤维细胞生长因子200微克，故来源十分有限。而且以往分离纯化酸性成纤维细胞生长因子的方法主要是通过硫酸铵盐盐析、阳离子交换层析和高压液相层析技术。但该方法工艺复杂，所获得的酸性成纤维细胞生长因子的纯度和得率很低，活性丢失也较严重，难以获得大量的高纯度和高生物活性的酸性成纤维细胞生长因子。1986年人们发现肿瘤抽提物中具有酸性成纤维细胞牛长因子生物活性的物质，能与肝素结合并进一步将固相肝素亲和层析法用于纯化酸性成纤维细胞生长因子，但仍然没有解决在纯化过程中酸性成纤维细胞生长因子生物活性丢失和得率低的问题。

哺乳动物心脏中的FGF样物质有两种，即aFGF和bFGF。纯化FGF有两个关键环节：a、防止蛋白水解酶对FGF分子的降解；b、防止FGF生物活性的丢失。日本学者HajimeSasaki等采用氯仿抽提和heparin-Sepharose亲和层析技术从心肌组织中纯化到较高含量的aFGF样物质。Hajime采用的氯仿抽提法虽然能有效的阻止蛋白水解酶对FGF的降解过程，获得较均一的酸性成纤维细胞生长因子aFGF，但该法易使碱性蛋白质变性失活。

本发明的目的是选择从哺乳动物心肌中提取酸性成纤维细胞生长因子，扩大酸性成纤维细胞生长因子的来源，并通过改进酸性成纤维细胞生长因子的提取技术，获得大量的高纯度和高生物活性的酸性成纤维细胞生长因子。采用本发明的方法还可在哺乳动物心肌中同时提取碱性成纤维细胞生长因子。

本发明是通过以下的技术方案实现的：一种从哺乳动物心肌中提取酸性成纤维细胞生长因子样物质的方法，包括如下步骤：(1)在哺乳动物心脏组织块中加入含苯甲基磺酰氟(PMSF)的酸性抽提液后将哺乳动物心脏进行匀浆化；(2)对抽提后得到的上清液至少进行一次酸沉淀；(3)将沉淀后得到的粗提物用截留值为8000～12000分子量的透析袋进行透析；(4)对透析得到的上清液进行柱层析和柱亲和层析分离；所述的酸性抽提液为0.15mol/l硫酸铵溶液，其中含0.5～1.0mmol/l的苯甲基磺酰氟(PMSF)；对抽提后得到的上清液用固体硫酸铵进行两次盐析沉淀；步骤(1)是在PH值3.5～4.5的酸度中进行；步骤(2)是在PH值5.5～6.5的酸度中进行；各步骤是在0～6℃的温度中进行；步骤(4)是采用羧甲基纤维素葡聚糖阳离子交换柱层析和柱亲和层析法从透析后的上清液中分离纯化酸性成纤维细胞生长因子样物质。