[发明专利]基因表达幽门螺杆菌细胞毒素相关基因A蛋白抗原制备工艺

权利要求书

1.一种基因表达幽门螺杆菌细胞毒素相关基因A蛋白抗原的制备工艺，在基因工程中质粒的制备和纯化、限制性内切酶水解、酶切后DNA纯化、DNA连结、连结物转化大肠杆菌受体菌、转化子筛选，按一般常规操作或采用市售商品试剂及试剂盒进行操作；

其特征在于，首先选用在细菌中产生融合蛋白和完全天然蛋白的质粒载体；在确定质粒载体后，使用与之相适应的大肠杆菌受体菌，以获得高表达率的基因工程菌；

然后制备目的DNA：

以CagA阳性菌染色体DNA为模板，用聚合酶链反应(PCR)扩增目的DNA片段；

(1)DNA模板

采用国际CagA阳性标准菌株，以及用国际标准菌株证实的国内外CagA阳性流行菌株的菌体染色体DNA作PCR扩增模板；

(2)引物    

选用CagA基因核苷酸2229-3018bp序列及根据载体酶切点的序列设计引物，使插入目的DNA表达符合读格；

(3)扩增反应

在0.5ml灭菌离心管内混合，其中

灭菌水30μl

10X扩增缓冲液  10μ1

4种dNTP混合物，每种浓度1.25mmol/L16μl

引物1(溶于5μl水)    100pmol

引物2(溶于5μl水)    100pmol

模板DNA    1ug

加水至终体积100μl

其中10X扩增缓冲液：

500m mol/LKCl

   100m mol/LTris.HCl(PH8.3室温)

   15m mol/LMgCl₂

    0.1％明胶

(4)扩增参数

上述混合液在94℃加热5分钟，加入2u Taq聚合酶，用100μl液体石蜡复盖反应混合液上，然后按以下参数进行扩增：

循环变性退火聚合

首轮循环  94℃5分钟50℃2分钟  72℃3分钟

后续循环  94℃1分钟50℃2分钟72℃3分钟

末轮循环  94℃1分钟50℃2分钟72℃10分钟

循环25～30次；

目的DNA与质粒DNA重组(连结)后转化大肠杆菌；

最后进行CagA蛋白抗原的表达和纯化：

重组质粒转化后，经小量培养筛选表达率高的重组转化子作为基因工程菌，基因工程菌经增菌及IPTG诱导后表达CagA蛋白抗原；

基因表达的CagA为近C末端蛋白抗原，其分子量大小随不同菌株而定，为27～38Kda：

CagA蛋白抗原的纯化需根据载体的情况使用融合蛋白抗体、相应抗体。亲和层析柱或HPLC进行。

2.一种基因表达幽门螺杆菌细胞毒素相关基因A蛋白抗原在消化道疾病的诊断预报中的制备应用，其特征在于，应用于产细胞毒素幽门螺杆菌免疫诊断试剂及试剂盒的制备，它包括检测产细胞毒素幽门螺杆菌抗原(CagA)及抗体(CagAIgG、CagA IgA、CagA IgM)的胶乳凝集检测试剂及试剂盒、金标记检测试剂及试剂盒、血球凝集检测试剂及试剂盒、萤光免疫检测试剂及试剂盒、酶免疫检测试剂及试剂盒、以及放射免疫检测试剂及试剂盒。

3.一种基因表达幽门螺杆菌细胞毒素相关基因A蛋白抗原在消化道疾病的预防中的制备应用，其特征在于，应用于疫苗的制备，包括口服疫苗和注射疫苗的制备。

4.一种基因表达幽门螺杆菌细胞毒素相关基因A蛋白抗原在消化道疾病的预防及治疗中的制备应用，其特征在于，制备包括单克隆抗体及多克隆抗体的CagA蛋白抗体及CagA蛋白拮抗物，用作特异性药物使之与胃、十二指肠产细胞毒素幽门螺杆菌结合，或作为保健品预防产细胞毒素幽门螺杆菌侵入胃、十二指肠组织。