[发明专利]一种重组大肠杆菌周质蛋白液的制备方法

说明书

本发明涉及基因工程中下游领域的蛋白质分离纯化，尤指重组大肠杆菌周质蛋白液的制备方法。

随着70年代基因工程技术的兴起，目前很多珍贵的药物蛋白及其它活性蛋白，如人生长激素，干扰素，白介素等都可利用基因工程大肠杆菌进行生产。

所谓基因工程大肠杆菌就是整合了外源基因的大肠杆菌，该外源基因编码目的蛋白，通过宿主大肠杆菌就可合成相应的目的蛋白。目前，大肠杆菌细胞中的外源蛋白有三种分泌形式，即胞外分泌，周质分泌，形成包涵体。其中最为常用的是包涵体形式，胞外分泌近年也逐步增多，而周质分泌型虽然也有诸多的优点但应用较少，其中的一个重要原因就是缺少有效的专用于细胞周质蛋白提取的工艺。胞外分泌型只需在细胞培养结束后，离心取上清液进行分离纯化。包涵体表达形式则要先对细胞进行破壁处理，然后利用包涵体与细胞碎片及胞内物质的密度差进行包涵体分离，收获包涵体作进一步纯化。而周质分泌型则需要定向释放技术，该技术的关键在于仅作用于细胞外膜而不损害细胞内膜和细胞壁。如果细胞壁和内膜损害程度太大，则胞内干扰物质大量释放到提取液中，将给目的蛋白的下一步纯化带来困难。

目前细胞周质的专用提取方法很少见，特别是适合于工业化生产的工艺还未见报道。目前已报道的周质制备方法有溶菌酶法[MolecularCloning-A Laboratory Manual 2nd ed.Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989]，蔗糖渗透压法[Comelis.P.,Mol.Gen.Genet.,1982,186:507～511]、低浓度胍处理法[T.J.Naglak and H.Y.Wang,EnzymeMicrob.Technol.,1990,12(8):603]，这些方法都不过是细胞全破碎方法的温和化而已，都未能解决细胞壁和内膜的受损害问题。因此，或多或少会使胞内物质，特别是对目的蛋白质的分离纯化有严重干扰的核酸大分子释放到提取液中。而杂蛋白及核酸的夹带不仅影响目的蛋白的纯化回收率，而且还会影响产品的质量。特别是这些方法在试验室小试规模可能还有一定效果，但却难以在工业规模中推广。

为此，本发明的目的是提供一种重组大肠杆菌周质蛋白液的制备方法，即盐处理法制备细胞周质液。该方法有效地防止了前述已有方法在制备细胞周质液时对细胞壁和内膜的损害，从而减少了细胞内干扰物质对蛋白分离纯化的影响。它不仅适合于实验室的小量制备，而且特别适合于工业化规模的生产。

本发明是一种重组大肠杆菌周质蛋白液的制备方法，通过盐的阳离子作用于重组大肠杆菌细胞以增加细胞外膜的通透性，从而达到专一抽提细胞周质中蛋白之目的。具体工艺步骤如下所述。

在重组大肠杆菌发酵结束之后，冷却发酵液温度(0～37℃均可，以0～15℃为佳)使细胞代谢降低，同时在发酵液中直接加入盐处理细胞。可用的盐类主要包括一价阳离子盐如钠盐如氯化钠、硫酸钠、硝酸钠等所有的可溶性钠盐，钾盐如氯化钾、硫酸钾、硝酸钾等所有可溶性钾盐，铵盐如氯化铵、硫酸铵、硝酸铵等所有可溶性铵盐，以及其它所有含一价阳离子的可溶性盐。如实施例1、2、3、4配合图2显示：钠盐、钾盐、铵盐如氯化钠、硫酸钠、氯化钾、硫酸铵效果相同。从成本上考虑，采用氯化钠最佳。

盐的加量和处理时间视不同的发酵工艺、品种、菌株而异，以盐中的阳离子摩尔浓度计，从78m mol～8000m mol为有效浓度范围。以氯化钠为例，如图3所示：钠离子浓度在78m mol～3440m mol范围内都有效果。针对不同的大肠杆菌及所涉及的各种蛋白，可能有不同的最佳浓度。加盐处理时间一般需10分钟以上，但不超过4小时，时间太长则有细胞自溶的可能。

本操作步骤也可如下进行：发酵结束后先离心发酵液收获菌体，然后将菌体温和分散于大于菌体体积的盐溶液中进行处理，工艺条件如离子浓度、温度、时间如同上述)

加盐处理完毕后，离心收集菌体，加入冷的提取液，温和分散菌体，低温抽提周质蛋白。

提取液一般使用蒸馏水即可，也可使用缓冲液如Tris缓冲液、磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液等作提取液，作为提取液的缓冲液和蒸馏水中也可加入某种蛋白保护剂如PMSF(蛋白酶抑制剂)、白蛋白、多糖等、也可加入盐促进蛋白质溶解(如氯化钠、氯化钾、硫酸铵等，浓度从50～150m mol)，也可加入离子螯合剂EDTA。如实施例7使用10mmolTris(PH=7.5)作提取液也取得相同的效果。