[发明专利]编码新胞子虫二氢叶酸还原酶－胸苷酸合成酶的DNA

说明书

本发明属于动物健康领域，涉及疫苗组合物和疾病诊断方法。更具体地说，本发明涉及含有编码新胞子虫(Neospora)二氢叶酸还原酶-胸苷酸合成酶(DHFR-TS)蛋白的核苷酸序列的多核苷酸分子，该多核苷酸分子在抗新胞子虫病(neosporosis)的疫苗生产中是很有用的，并可用作诊断试剂。

新胞子虫是动物的一种病原性原生动物寄生虫，已发现它是导致哺乳动物流产、新生儿死亡、先天性感染和脑炎疾病的主要原因(Dubey和Lindsay,1996，兽医寄生虫学,67:1-59；Dubey和Lindsay,1993，今日寄生虫学，9:452-458)。N.caninum(Neospora caninum)可感染狗，并可先天性地感染小狗，通常会导致瘫痪。已经从天然感染的小狗内分离出了N.caninum的速殖体(Lindsay和Dubey,1989，寄生虫学杂志，75:163-165)。新胞子虫是导致奶牛场中牛流产的主要原因。在山羊、绵羊和马中也已有新胞子虫相关性疾病即新胞子虫病病例的报道。

尽管N.caninum表面上看起来与病原鼠弓形体(Toxoplasmagondii)类似，但N.caninum与鼠弓形体在抗原性和超微结构方面都互不相同(Dubey和Lindsay,1993，文献同上)。另外，从流产的牛胎儿脑中分离出的并在体外持续培养的新胞子虫样原生动物寄生虫与鼠弓形体和Hammondia hammondi在抗原性和超微结构方面都存在明显差异，而与N.caninum最为相似(Conrad等，1993，寄生虫学，106:239-249)。而且，对核小亚基核糖体RNA基因的分析结果表明分离自牛和狗的新胞子虫株系之间无核苷酸差异，但新胞子虫和鼠弓形体之间存在一致的差异(Marsh等，1995，寄生虫学杂志，81:530-535)。

已经证实新胞子虫牛分离物在牛流产和先天性疾病中具有黄化作用(Barr等，1994，兽医诊断与研究杂志，6:207-215)。利用感染有N.caninum的近交BALB/c小鼠已建立了中枢神经系统新胞子虫病的啮齿类动物模型(Lindsay等，1995，寄生虫学杂志，81:313-315)。另外，分别由Cole等，1995，寄生虫学杂志，81:730-732，及Long等，1996，寄生虫学杂志，82:608-611描述了用于研究远交和近交孕鼠中N.caninum的跨胎盘传播的模型。而且，已证实N.caninum矮小山羊实验模型与天然获得的新胞子虫诱导性牛流产非常相似(Lindsay等，1995，美国兽医研究杂志，56:1176-1180)。

在原生动物如鼠弓形体和新胞子虫中，已知必需的代谢酶类：二氢叶酸还原酶(DHFR)和胸苷酸合成酶(TS)位于同一蛋白质分子内两个不同的酶促结构域即“DHFR结构域”和“TS结构域”中。据报道，鼠弓形体中DHFR和TS结构域由一个约70个氨基酸的连接区所隔离(Roos,1993，生物化学杂志，162:6269-6280)。至少在一种寄生虫种类中已将此双功能蛋白质用作缺失靶点以产生弱毒株系而用于活体疫苗中。因此，Titus等，1995，美国国家科学院院报，92:10267-10271描述了通过同源重组对来源于原生动物寄生虫大型利什曼原虫的DHFR-TS基因进行定位缺失，以产生DHFR-TS-无效突变体细胞从而用于抗大型利什曼原虫强致病株的疫苗中。

本发明提供了含有编码新胞子虫DHFR-TS蛋白的核苷酸序列的分离的多核苷酸分子。在一个优选实施方案中，该新胞子虫DHFR-TS蛋白含有SEQ ID NO:3的氨基酸序列或由存在于噬菌体λNcIDHFRTS(ATCC No.209512)内的DHFR-TS基因所编码的DHFR-TS蛋白的氨基酸序列。在一个非限制性的实施方案中，该分离的多核苷酸分子含有所说的新胞子虫DHFR-TS基因的核苷酸序列。在一个优选实施方案中，含有新胞子虫DHFR-TS基因的核苷酸序列的该分离的多核苷酸分子含有SEQ ID NO:1中从大约第2405nt至大约第8199nt的核苷酸序列，或与存在于噬菌体λNcIDHFRTS(ATCC No:209512)中的DHFR-TS基因的核苷酸序列相同的核苷酸序列。在另一个非限制性的实施方案中，所述编码DHFR-TS蛋白的多核苷酸分子含有SEQ ID NO:2的核苷酸序列。