[发明专利]重组中国汉族人源γ－干扰素及生产方法

说明书

本发明为重组中国汉族人源γ-干扰素及生产方法，更具体地说包括中国汉族人源γ-干扰素cDNA的分离、表达质粒和表达菌株的构建、中国汉族人源γ-干扰素的生产方法及中国汉族人源γ-干扰素的生物学活性鉴定等方面。

干扰素(Interferon，IFN)是由多种细胞因子组成的异源家族。诱导细胞对病毒感染产生抗性是干扰素家族共有的生物学活性。大多数的干扰素可归属于三个亚类，即α，β和γ干扰素，其中γ-干扰素(γ-干扰素)又称免疫干扰素，它具有调节机体免疫功能、抗肿瘤、抗病毒等多种生物学功能及临床适应症，具有广阔的市场和重要的社会和经济效益。根据我们发现的分子进化规律的预测，东西方人群间γ-干扰素cDNA存在序列多态性。随后我们克隆了中国汉族人源γ-干扰素cDNA，并证明与Gray等报导的γ-干扰素cDNA序列存在两个核苷酸位点的差异，并导致在蛋白质水平上存在一个氨基酸位点的差别。而目前国内生产和使用的γ-干扰素均源于西方人序列，中国人长期使用与内源性γ-干扰素序列不同的西方人源γ-干扰素将会诱发产生抗体及其它副作用等问题。

本发明的目的在于提供一种中国汉族人源γ-干扰素，属于人源γ-干扰素新变异型。本发明的另一个目的是通过中国汉族人源γ-干扰素cDNA的克隆，表达菌株的构建、发酵、纯化及复性生产具有生物学活性的重组中国汉族人源γ-干扰素。

本发明的技术途径是从健康中国汉族人外周血单个核细胞中分离总RNA、通过反转录PCR克隆中国汉族人源γ-干扰素cDNA、构建高效表达载体和高效表达菌株、进行工程菌发酵、包涵体的分离与裂解、蛋白质的纯化和复性，最终获得具有生物学活性的重组中国汉族人源γ-干扰素纯品。其特征为：1)从中国汉族人外周血单个核细胞中经反转录PCR克隆到中国汉族人源γ-干扰素cDNA。2)中国汉族人源γ-干扰素具有表1所列的核苷酸序列和氨基酸序。

                  表1ATG TGT TAC TGC CAG GAC CCA TAT GTA AAA GAA GCA GAA    39 M   C   Y   C   Q   D   P   Y   V   K   E   A   E     13AAC CTT AAG AAA TAT TTT AAT GCA GGT CAT TCA GAT GTA    78 N   L   K   K   Y   F   N   A   G   H   S   D   V     26GCG GAT AAT GGA ACT CTT TTC TTA GGC ATT TTG AAG AAT   117 A   D   N   G   T   L   F   L   G   I   L   K   N     39TGG AAA GAG GAG AGT GAC AGA AAA ATA ATG CAG AGC CAA   156 F   K   E   E   S   D   R   K   I   M   Q   S   Q    542ATT GTC TCC TTT TAC TTC AAA CTT TTT AGA AAC TTT AAA    195 I   V   S   F   Y   F   K   L   F   R   N   F   K      65GAT GAC CAG AGC ATC CAA AAG AGT GTG GAG ACC ATC AAG    234 D   D   Q   S   I   Q   K   S   V   E   T   I   K      78GAA GAC ATG AAT GTC AAG TTT TTC AAT AGC AAC AAA AAG    273 E   D   M   N   V   K   F   F   N   S   N   K   K      91AAA CGA GAT GAC TTC GAA AAG CTG ACT AAT TAT TCG GTA    312 K   R   D   D   F   E   K   L   T   N   Y   S   V     104ACT GAC TTG AAT GTC CAA CGC AAA GCA ATA CAT GAA CTC    351 T   D   L   N   V   Q   R   K   A   I   H   E   L     117ATC CAA GTG ATG GCT GAA CTG TCG CCA GCA GCT AAA ACA    390 I   Q   V   M   A   E   L   S   P   A   A   K   T     130GGG AAG CGG AAA AGG AGT CAG ATG CTG TTT CGA GGT CGA    429 G   K   R   K   R   S   Q   M   L   F   R   G   R     143AGA GCA TCC CAG TAA   444 R   A   S   Q        147