[发明专利]用蚕表达重组人的促红细胞生成素制备药物的方法

说明书

本发明属于生物技术制药工业中的基因工程生产多肽类药物技术领域。

糖蛋白激素促红细胞生成素(EPO)是调控红细胞生产的主要激素。人体染色体组的红细胞生成素基因存在于一个5.4kb HindIII-BamH I性内切酶切片段中，由27个氨基酸信号多肽及166个氨基酸组成的分子量约18KD的成熟蛋白质编码。此蛋白质含3个N键和1个O键糖基化部位及二组二硫键。染色体中红细胞生成素基因以单拷贝存在，位于人染色体7q11-q22区域。促红细胞生成素通过与它在红细胞原体细胞膜表面上的受体结合而诱使红细胞原体增殖及分化，这种红细胞形成单位主要是红细胞系集落形成单位(CFU-E)及爆式红系集落形成单位(BFU-E)。

在人体内，红细胞水平受到促红细胞生成素的密切调控，此激素以微小的量存在于循环中，在正常条件下约为10-30mμ/ml血清。在胎儿中，促红细胞生成素主要由肝脏生产，而出生后促红细胞生成素则转由肾脏生产。促红细胞生成素作为活性分子分泌进入循环，它激活带促红细胞生成素受体的红细胞原体，主要促使爆式红系集落形成单位及红细胞系集落形成单位的增殖与分化，使之成为成熟的红细胞一个细胞原体细胞可生产高达几千个红细胞。当肾功能遭到损坏或失去肾的情况下，红细胞生成素的生产会减少，便会出现贫血。

家蚕杆状病毒基因组为共价闭合环状双链DNA，分子量约为130kb，可以在多角体蛋白基因启动子下游插入外源基因，以家蚕作为生物反应器，可以高效表达外源基因。家蚕杆状病毒属真核表达系统，可识别分泌信号、表达产物后加工比较完善，可形成与天然蛋白相似的高级结构，产物的天然性好。到目前为止，尚无用从蚕中表达促红细胞生长素制备药物的报道和专利。

从人的肾细胞中获得促红细胞生成素的基因，与家蚕杆状病毒载体重组，在家蚕细胞中进行重组、获得高效表达人的促红细胞生成素的重组病毒，在家蚕幼虫、蛹中高效表达，经过纯化可得纯度为95％的促红细胞生成素以及用蛹表达产物，经过初纯化，冷冻干燥制成口服药物，经动物试验证明促红细胞药效显著，具体技术操作过程如下：

1.人的肾细胞的mRNA的制备

人的肾细胞100mg，低温下磨碎，加入GIBCOBRL公司生产Trizol RNA提取液1ml，轻轻摇动10分钟后加入500μl氯仿，在室温下放置10分钟，12000rpm离心10分钟，取上清，加入2倍体积的乙醇，混匀后，12000rpm离心10分钟，弃上清，加入反转录酶及4dNTP进行反转录，37℃，1小时，获得由mRNA反转录合成的cDNA。

2.将第1步获得的cDNA，加入促红细胞生成素基因的上下游引物，5’AAGATCTGAATTCCGGAGATGGGGGTGCACG3′以及5’GGGATCCTTGCGGCTTCCCTTCTGCCAAGGAG3’进行PCR扩增，Taq酶为宝灵曼公司的高保真Taq酶，反应条件为预变性94℃，10分钟，变性温度94℃，45秒，延伸温度为72℃，90秒，复性温度45℃，60秒，循环30次，最后72℃延伸10分钟。获得长度为600 bp的促红细胞生成素基因片段。

3.将PCR产物经过低融点胶分离回收，加1ml饱和苯酚(pH8.0)，65℃作用10分钟，12000rpm离心10分钟，取上清，用苯酚再抽提一次。取上清加等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)，混合5分钟，12000rpm离心10分钟，取上清，加入2倍无水乙醇，混合均匀，置-20℃，2小时后再用12000rpm离心10分钟，弃上清，用70％乙醇洗沉淀，12000rpm离心1分钟，弃上清，自然干燥，沉淀用20μlTE缓冲液溶解，置于-20℃冰箱。

4.用宝灵曼公司pUC19质粒，经Sma I酶切后，与上述促红细胞生成素基因连接，连接酶为GIBCO BRL公司产品，连接条件为20℃，12小时。连接产物转化大肠杆菌JM109菌株(购自promega公司)，通过蓝白斑筛选获得重组质粒，小批量提取质粒(提取方法参见“分子克隆”，1989，科学出版社)，用EcoR I和BamH I酶切鉴定，有一条约600bp的片段被克隆，证明促红细胞生成素基因已被克隆成功，所获得的重组质粒称之为pUC19 EPO。