[发明专利]用随机或确定的引物来重组多核苷酸序列

说明书

依照能源部授予的No.DE-FG02-93-CH10578号资助和海洋研究部授予的No.N00014-96-1-0340资助，美国政府对于本发明享有一定的权利。

发明背景

1．发明领域

本发明总的来讲涉及多核苷酸序列体外诱变和重组的方法。更具体地，本发明包括一种以聚合酶催化引物寡核苷酸延伸为基础进行多核苷酸序列体外诱变和重组，然后进行基因装配和任选地基因扩增的简单而有效的方法。

2．相关领域描述

本文中提到的用来描述本发明背景以及提供附加关于其实践的详细描述的出版物和其它参考材料均结合人本文作参考。为方便起见，参考材料用数字来引述，它们归纳在附加的书目中。

构造蛋白质工程化的目的是要改善它们在实践应用中的性能。所需的性能与其感兴趣的应用有关，可以包括更牢固地与受体结合、高的催化活性、高的稳定性、接受较宽(或较窄)范围底物的能力或是在非自然环境如有机溶剂中起作用的能力。各种方法(包括“理性”设计和随机诱变的方法)已经被成功用来优化蛋白质功能(1)。对于给定的优化课题，方法的选择将取决于对序列，结构和功能之间关系的了解程度。例如，理性地重新设计酶的催化部位通常需要对酶结构、酶与各种配体的复合体的结构、反应中间产物的类似物以及催化机理的详细情况有广泛的了解。这些信息对于少数已经充分研究的系统来说是可以获得的，但是对于大部分有潜在价值的酶还知之甚少。对于决定已有蛋白质功能的氨基酸以及可能会产生新功能的氨基酸的鉴定仍旧是令人困扰的问题。这个问题，以及人们逐渐知道许多蛋白质的功能并不局限于少量氨基酸而是受远离活性位点的残基影响的事实，都促使大量精力转向随机诱变或“定向”进化来构造新的蛋白质(1)。

自然进化已经启发了各种优化方法如基因算法(2,3)和进化策略(4,5)。这些方法采用诱变(在种群成员中作少量随机的变化)和交换(结合不同个体的性能)来实现特定的优化目的。如不同的优化问题的计算机模拟所显示的，诱变和交换间也存在强的相互作用(6-9)。发展有效且实用的试验技术来模仿这些关键方法是一个科学挑战。这些技术的应用应使技术人员能在体内或甚至完全脱离生存系统限制下研究和优化生物分子，如蛋白质和核酸(10,11)。

受自然进化的启发，定向进化方法包括生成诱变分子的库并进行选择或筛选，该分子库有足够的多样性能编码功能变化或增强的蛋白质分子。它通常首先是生成诱变基因文库。在所需性能或所需一系列性能方面有所改进的基因产物可通过选择或筛选来鉴定。可对编码这些产物的基因再循环进行该方法，以积累有利的突变。该进化方法可包括几代或许多代，这由所希望进展的程度和每一代中观察到的典型的突变效果来确定。这些方法可用来生成有新功能的核酸(12)、肽和其它小分子(12)、抗体(12)以及酶和其它蛋白质(13、14、16)。定向进化不需要非常了解产物本身，它只是一种评价待优化功能的方法。这些方法允许在功能评价中有误差和噪扰。

通过采用各种方法(包括PCR诱变(15)或组合盒式诱变(16))引入新的点突变，可使定向进化中的基因产生多样性。然而，由于基因在自然进化中起重要作用，因此，重组基因的能力可为进化过程提供重要的发展方向。同源重组是一个重要的自然过程，在该过程中有机体在相关的基因之间交换遗传信息，从而增加了物种内可及基因的多样性。在将潜在的强适应性和多样化竞争引入它们的宿主中的同时，这些途径也在非常低的效率下进行，通常甚至是在数十代后也只会在途径结构或功能上引起不显著的变化。因此，尽管这些机理在地质时代期间对宿主有机体/物种有利，但体内重组的方法是不适用的，如果不是不能采用，设计酶或其它蛋白质性能的重组方法与有机体的中间代谢及存活没有很大的关系。