[发明专利]一种耐热的内切－β－1,4－葡聚糖酶

说明书

发明领域

本发明涉及一种在高温时有纤维素分解活性的酶，特别是内切-β-1，4-葡聚糖酶；编码该有纤维素分解活性的酶的克隆DNA序列；提供编码这种酶的基因的方法；生产这种酶的方法；一种含有所述具纤维素分解活性的酶的酶组合物；以及该酶和酶组合物的多种工业应用。

发明背景

纤维素酶或纤维素分解酶是参与纤维素水解过程的酶。天然纤维素的水解中，众所周知有三类主要的纤维素酶参与这一过程，即纤维素二糖水解酶(1，4-β-D-葡聚糖纤维素二糖水解酶，EC3.2.1.91)，内切-β-1，4-葡聚糖酶(内切-1，4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶，EC3.2.1.4)和β-葡糖苷酶(EC3.2.1.21)。

特别是内切-β-1，4-葡聚糖酶(EC3.2.1.4)构成一组可用于上述工业用途的引人注意的水解酶。内切-β-1，4-葡聚糖酶催化纤维素、纤维素衍生物(例如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣多糖中1，4-β-D-糖苷键的内切水解，及混合β-1，3-葡聚糖，如谷类β-D-葡聚糖或木糖葡聚糖(xyloglucan)和含有纤维素部分的其他植物材料中的β-1，4键的内切水解。其权威命名是内切-1，4-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶，本说明书使用简称内切-β-1，4-葡聚糖酶。可以参考T.M.Enveri，“微生物纤维素酶”，W.M.Fogarty，微生物酶类与生物技术，应用科学出版社，183-224页(1983)；酶学方法(1988)160卷，200-391页(Wood，W.A和Kellogg，S.T.编)；Beguin，P.“纤维素降解的分子生物学”，微生物学年度综述(1990)，44卷，219-248页；Beguin，P.和Aubert，J-P.“纤维素的生物降解”，FEMS微生物学综述13(1994)25-58页；Henrissat，B.“纤维素酶及它们与纤维素的相互作用”，纤维素(1994)，1卷，169-196页。

纤维素酶在大量微生物中都能合成，包括真菌，放线菌，粘细菌和真细菌，也能由植物合成。特别是已鉴定到具有各种特异性的内切-β-1，4-葡聚糖酶。已描述过许多细菌内切-β-1，4-葡聚糖酶(Henrissat，B.和Bairoch，A.(1993)生物化学杂志293：781-788；Gilbert，H.J.和Hazlewood，G.P.(1993)普通微生物学杂志139：187-194)。

比较上位的分类组古生物(Archaea)分成两个门：Euryarchaeota和Crenarchaeota。古生物中Euryarchaeota门内的热球菌目包含热球菌属(Pyrococcus)和热球菌属(Thermococcus)(Maidak等，1996)。这些生物体分离自海洋或陆地硫酸盐环境中，它们是厌氧性生物，高度嗜热。激烈热球菌在100℃时生长情况最好，并且最高生长温度是103℃。在15-35g/l NaCl存在时可达到最佳生长状况。已有记载表明激烈热球菌利用肽、蛋白质、淀粉以及麦芽糖作为碳源(Zilling，1992)。

来自多种古生物的各种细胞外酶已有记载。例如，已在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中克隆和表达了来自激烈热球菌DSM 3638、最适温度约为100℃的一种淀粉酶(国际专利申请PCT/DK/90/00074)。来自各种古生物的其它水解酶(如细胞外木聚糖酶、β-甘露糖苷酶和β-半乳糖苷酶)以及胞内蛋白酶都有记载(Halio等，1996)。

已记载、鉴定和克隆了一种来自激烈热球菌DSM 3638的β-葡糖苷酶(Kengen，1993)。对该激烈热球菌β-葡糖苷酶的鉴定工作揭示出，该酶对纤维素或其它β-连接的葡萄糖聚合物没有活性(Bauer等，1996)。WO 97/44361(第115-117页)中公开了一种多核苷酸序列，该序列编码来自激烈热球菌、具有内切-β-1，4-葡聚糖酶活性的一种多肽。Thermophilum pendens是与古生物Crenarchaeota门热棒菌属有关的一种生物，已证实它能产生少量在88℃对羧甲基纤维素有活性的葡聚糖酶。然而，无论是酶还是分离物，都未见有进一步鉴定的记载(Bragger等，1989)。