[发明专利]纯化生物物质的连续流动等电聚焦方法和设备

说明书

发明领域

本发明涉及通过连续流动等电聚焦(isoelectric focusing)的新方法(连续聚焦)和设备(连续聚焦器，contifocuser)纯化、离析、浓缩和分离有机或生物物质，一种利用低电导场(electrically low-conductivefield)浓缩或分离带电物质的技术。不必使用离心、过滤、吸附或载体电解质或两性电解质缓冲液以建立合适的pH梯度。

用等电聚焦分离带电分子，如从含蛋白质的混合物中分离蛋白质，是已知技术，其原理是带电两性分子在特定pH，即所谓的等电点(pI值)下净电荷为零。如果经受一电场，物质将迁移到自身等电点的pH，因此得到分离。

静电等电聚焦方法和设备是已知的，例如公开在WO79/00942、EP-A-256552和US 5,256,269中。这种类型设备的缺点是纯化量少，其收集是以批式操作进行的。本发明技术背景描述在US 4,465,582(1982)中的连续流动电泳设备中，在电极室中应用了控制的流体流动，流动是平行的，但独立于“工作”室中的流动。

US 5,160,594公开了一种等电聚焦设备，在每一个槽中具有强制循环，即循环等电聚焦过程。在本发明中不使用循环。美国专利使用一串装置以防止部分纯化的和未纯化的两性物质之间的混合。在每个槽中需要附加冷却来降低电阻的发热。通过离子选择膜，将强酸和强碱，即阴极电解液和阳极电解液限制在电极室中，以抗御带负电或正电的离子，并建立合适的pH梯度。与US 5,160,594不同，本发明使用离子选择膜用于不同的目的，即选择允许低分子物质通过电极空间，并从电极流出口排出。所有现有技术中的装置都需要载体两性电解质用于工作室，它们具有相对低的电导率和缓冲能力。US 5,160594公开的最大电导率高达600μS/cm，比本发明的高达5000μS/cm的电导率低得多。与其它现有技术的装置一样，不是设计用来在工业规模上进行纯化的，此外，US 5,160,594没有提供纯化物质的实施例。

不使用载体两性电解质缓冲溶液，但用于工业规模的连续流动等电聚焦方法和设备公开在匈牙利专利210,584(1992)中。该专利描述了一种通过迁移(gravitation)到分离室达到流出口高度的上流系统。该系统具有两个非导电溶液室，其中第二室具有两个或多个溶液流出口，以及一个溶液从第一室流入第二室底部的下流通道。一对电极位于第二室。在第二室中设置多个相邻的间壁，间壁延伸穿过该室，以在水平方向上基本上没有溶液的对流和逆流通道。HU 210,584的缺点是在流入溶液室中，可能自身形成梯度。溶液的流入是通过滴加进行的，难以控制。与本发明类似，匈牙利专利中的上流系统的固有梯度形成不易受损，但是，两室系统复杂，难于构造。此外，有机溶液的分离发生在第二分离室的相对两侧，靠近电极。无机离子容易与要分离的单组分无机或生物物质混合。通过需要第二分离步骤。

发明描述

本发明提供一种在导电溶液中分离物质的连续聚焦器，该设备是由非导电材料制成，包括一个砖块状的分离室，其具有一个液体流入口，两个电极空间流出口，一个或多个工作溶液流出口，以及溶液从底部向上流动到顶部流出口的通道。分离室的高度、宽度和深度的比可以如3∶2∶0.2。沿分离室的两个最窄的相对壁的竖向位置上设置一对电极。它们用于连接外部直流(DC)电源。

设备被两个由离子选择膜制成的间壁分为三部分。这些间壁在设备中靠近电极的两侧垂直定位，以至于它们中的每一个都离开两端约1/25-1/15。两间壁在底部都有开孔，其直径为设备流入管的一半。特别地，包围阴极空间的是阳离子选择膜，而另一个是阴离子选择膜。离子选择膜具有选择允许阳离子或阴离子通过的专一性以从废物流出口清除。

在两端，废物流出孔位于电极附近，与顶边的距离为设备的1/40-1/10。工作流出口用于收集要纯化和物质，位于相同的高度，在中间。有利的是连续聚焦器具有至少三个所述流出口。除电极空间外，在流出口之间是由非导电材料制成的分割间壁，其上部四分之一闭合，从底部向上，如至其高度的四分之三处具有小的开孔。