[发明专利]修饰的羧肽酶

权利要求书

1.一种用于对含有具有带正电侧链的P₁氨基酸残基的肽底物进行转酰胺基作用的方法，此方法包括：

在修饰的羧肽酶Y的参与下使肽底物与亲核物质反应，其中修饰的羧肽酶包含至少一个在S₁亚位点中使用具有带负电侧链的氨基酸的替换。

2.权利要求1的方法，其中修饰的羧肽酶包含至少一个在氨基酸残基L178、W312、N241或L245处的替换。

3.权利要求2的方法，其中L178、W312、N241或L245中的至少一个由天冬氨酸或谷氨酸替换。

4.权利要求1的方法，其中亲核物质包括氨基酸酯或氨基酸酰胺。

5.权利要求4的方法，其中亲核物质包括Leu-OH、Leu-OR或Leu-NRR’。

6.权利要求1的方法，其中修饰的羧肽酶包含至少一个在S₁’、S₂或S₃亚位点中的替换的氨基酸。

7.权利要求1的方法，其中修饰的羧肽酶进一步包含至少一个选自N51Q、T60W、T60Y、T60A、M398L、M398G、M398A、M398V、M398I、M398F、M398Y、M398C、M398N和M398E的S₁’亚位点中的替换。

8.权利要求7的方法，其中修饰的羧肽酶进一步包含在S₁’亚位点中的两个或多个氨基酸替换。

9.权利要求8的方法，其中S₁’亚位点中的两个或多个替换包括至少一个T60位的替换和至少一个M398位的替换。

10.权利要求9的方法，其中T60位的替换是T60F、T60L、T60Y或T60D。

11.权利要求9的方法，其中M398位的替换是M398F、M398L或M398Y。

12.权利要求1的方法，其中修饰的羧肽酶进一步包含在S₂亚位点中的至少一个氨基酸替换。

13.权利要求12的方法，其中S₂亚位点中的替换是在E296、S297或N303位的至少其中之一中。

14.权利要求12的方法，其中S₂亚位点中的替换是E296F、S297A、N303A或N303F。

15.权利要求12的方法，其中肽底物在P₂包含丙氨酸残基。

16.权利要求1的方法，其中修饰的羧肽酶Y进一步包含至少一个能与具有带正电侧链的肽底物P₃残基相互作用的氨基酸残基的第二个替换。

17.权利要求1的方法，其中修饰的羧肽酶包含至少一个能与肽底物P₃残基相互作用的氨基酸残基的第二个替换，其中第二个替换引入具有带负电侧链的氨基酸。

18.权利要求16的方法，其中第二个替换是在N241、N242、L245或A246位的至少其中之一中。

19.权利要求1的方法，其中反应是在约pH6.3到约pH6.7进行。

20.修饰的羧肽酶Y，包含在N241或N245位的至少其中之一中的替换的氨基酸，其中替换的氨基酸有带负电的侧链。

21.权利要求20的修饰的羧肽酶，进一步包含至少一个在S₁’、S₂或S₃亚位点中的替换的氨基酸残基。

22.权利要求20的修饰的羧肽酶，进一步包含在L178或W312位的至少其中之一中的替换的氨基酸残基。

23.权利要求20的修饰的羧肽酶，进一步包含替换L178S和M398L。