[发明专利]将基因整合至哺乳动物细胞特定位点的方法及所用载体

权利要求书

1.在哺乳动物细胞基因组的靶位点插入所需DNA的方法，所述方法包括下列步骤：

(i)用第一个质粒(“标记质粒”)转染或转化哺乳动物细胞，所述质粒含有下列序列：

一个不常见的限制性内切核酸酶序列(a)对哺乳动物细胞基因组而言为异源的DNA区域，当该区域整合至哺乳动物细胞基因组时，可为同源重组提供独一无二的位点；

一个不常见的限制性内切核酸酶序列(b)编码第一个选择标记蛋白部分的DNA片断；和

一个不常见的限制性内切核酸酶序列(c)至少一种其它选择标记DNA，该DNA有助于选择被标记质粒成功整合的哺乳动物细胞；

(ii)选择含有标记质粒的细胞，所述质粒已整合至该细胞的基因组中；

(iii)用第二个质粒(“靶向质粒”)转染或转化所述选定细胞，所述质粒含有下列序列：

一个不常见的限制性内切核酸酶序列(a)DNA区域，该区域与标记质粒中独一无二的区域相同或与其具有足够的同源性以使所述DNA区域能经由同源重组与所述DNA重组；

一个不常见的限制性内切核酸酶序列(b)编码与标记质粒中所含选择标记相同的选择标记部分的DNA片断，其中仅当所述片断与标记质粒中所含的所述选择标记DNA片断联合表达时，才会产生由所述DNA编码的活性选择标记蛋白；和

一个不常见的限制性内切核酸酶序列(iv)通过筛选第一个选择标记蛋白的表达选择出含有靶向质粒的细胞，所述质粒整合至靶位点。

2.权利要求1的方法，其中编码第一个选择标记片断的DNA片断是显性选择标记的一个外显子。

3.权利要求2的方法，其中第二个质粒含有所述第一个选择标记的其余外显子。

4.权利要求3的方法，其中至少一种编码所需蛋白质的DNA被插入靶向质粒所含第一个选择标记的外显子之间。

5.权利要求4的方法，其中还将编码显性选择标记的DNA插入靶向质粒所含第一个选择标记的外显子之间以共扩增编码所需蛋白质的DNA。

6.权利要求3的方法，其中第一个显性选择标记选自新霉素磷酸转移酶，组氨醇脱氢酶，二氢叶酸还原酶，潮霉素磷酸转移酶，单纯疱疹病毒胸苷激酶，腺苷脱氨酶，谷氨酰胺合成酶和次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶。

7.权利要求4的方法，其中所需蛋白质是哺乳动物蛋白质。

8.权利要求7的方法，其中蛋白质是免疫球蛋白。

9.权利要求1的方法，其进一步包括在整合靶向载体之前，测定标记质粒中所含选择标记(c)的RNA水平。

10.权利要求9的方法，其中标记质粒中所含的其它选择标记是显性选择标记，它选自组氨醇脱氢酶，单纯疱疹病毒胸苷激酶，潮霉素磷酸转移酶，腺苷脱氨酶和谷氨酰胺合成酶。

11.权利要求1的方法，其中哺乳动物细胞选自中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，骨髓瘤细胞，幼仓鼠肾细胞，COS细胞，NSO细胞，HeLa细胞和NIH 3T3细胞。

12.权利要求11的方法，其中细胞是CHO细胞。

13.权利要求1的方法，其中标记质粒含有新霉素磷酸转移酶基因的第三个外显子，靶向质粒含有新霉素磷酸转移酶基因的前两个外显子。

14.权利要求1的方法，其中标记质粒还含有一个不常见的限制性内切核酸酶序列，所述序列被插入同源性区域内。

15.权利要求1的方法，其中提供同源重组的独一无二的DNA区域是细菌DNA，病毒DNA或合成的DNA。

16.权利要求1的方法，其中提供同源重组的独一无二的DNA区域至少为300个核苷酸。

17.权利要求16的方法，其中独一无二的DNA区域的大小范围约为300个核苷酸至20个千碱基。

18.权利要求17的方法，其中独一无二的DNA区域的优选大小范围为2至10个千碱基。

19.权利要求1的方法，其中第一个选择标记DNA至少被分成3个外显子。