[发明专利]蔗糖结合蛋白

说明书

发明领域

本发明涉及植物中的碳水化合物代谢，具体地讲，涉及蔗糖结合蛋白(SBP)。本发明内容包括从大豆中分离出来新的SBP基因，以及表现增强的蔗糖摄取活性的修饰的SBP。同时也提供了具有被改变的蔗糖摄取活性的核酸载体、转基因细胞和转基因植物。本发明还涉及用于调控转基因(包括SBP转基因)在植物中表达的启动子序列。发明背景

在植物中蔗糖运输的调节是影响植物生长和生产力的主要因素。通过光和作用，植物将大气中的二氧化碳固定为磷酸丙糖，然后磷酸丙糖用于生产蔗糖和其它碳水化合物。然后这些碳水化合物被运输到植物各处作为能源蔗糖、生物合成的碳骨架以及未来生长需要的储备。蔗糖是被输送的碳水化合物的主要形式。植物细胞主动运输蔗糖穿过原生质膜的能力，以至于固定在韧皮部的蔗糖能够被吸收到细胞中使用，是蔗糖利用的关键步骤。

植物种子的形成涉及碳的累积和氮的储备，储备的形式既可以抵御干燥又可以用作在萌发过程中胚的发育能源。种子形成过程中碳的累积由特异的原生质膜蛋白质介导(Overvoorde等，1996；Riesmeier等，1992；Bush，1993)。用可光解蔗糖类似物对从大豆子叶组织分离出来的膜经光亲和力标记鉴定出一种独特的62 kD蔗糖结合蛋白，或称SBP(Ripp等，1988)。对编码SBP的cDNA及由其推断出来的氨基酸序列分析表明，SBP在其N-末端有一个疏水区，除此之外，SBP是一个缺乏普遍存在于运输蛋白质中的跨膜疏水片段的亲水蛋白质(Grimes等，1992)。SBP的拓扑学的生化分析证明它与原生质膜的外部小叶密切相关(Overvorrde和Grimes，1994)。免疫定位试验证实SBP是细胞原生质膜上涉及蔗糖主动吸收的唯一相关蛋白质，说明SBP可能在蔗糖的摄取过程中发挥作用(Grimes等，1992)。在酵母系统中由SBP介导的蔗糖摄取的动力学分析表明，该摄取虽为蔗糖特异性，但是质子非依赖性的，且为相对不饱和性的，因此界定了一种新的蔗糖摄取机制(Overvoorde等，1996)。

种子形成中对蔗糖的摄取影响成熟种子的两个典型农业特征：所结籽粒的碳水化合物含量，以及籽粒种植后长出的幼苗的活力。当对增加种子中的碳水化合物含量有利时(例如，种子是收获的主要植物材料，例如大豆)，在种子形成中增强蔗糖摄取活性应该是理想的。相反，当收获的是植物的无性材料时，降低种子中的蔗糖摄取活性就应当是理想的。因此，种子形成过程中，蔗糖摄取活性改变的植物将具有显著的农业重要性，本发明即是针对这些植物。发明概述

本发明提供了编码植物蔗糖结合蛋白的分离的核酸分子，该蔗糖结合蛋白是种子形成过程中负责蔗糖摄取的关键蛋白质。在一个实施方案中，本发明提供了蔗糖结合蛋白的修饰型，其表现出增强的蔗糖摄取活性。

以前描述的来源于大豆的蔗糖结合蛋白(Overvoode等，1996)在本文中称为SBP1。本文提供了一种新的SBP，称为SBP2。SBP2多肽的长度为489个氨基酸残基，在种子形成过程中显示其表达水平增强。在异源酵母分析系统中SBP2多肽显示具有蔗糖摄取活性。

另外，本发明提供了SBP1和SBP2蛋白质的修饰形式，其具有增强的蔗糖摄取活性。在一个实施方案中，这种形式是去除上述蛋白质C-末端氨基酸残基的缺失突变体。举例说明，去除SBP1蛋白质C-末端的80个氨基酸残基，得到的蛋白质在酵母分析系统中表现出增强的蔗糖摄取活性。

本发明还提供了大豆SBP1和SBP2基因的5’调节区(包括启动子序列)。这些调节区允许种子形成中的特异性的或增强的表达，因此可以用于表达种子形成中的任何转基因。

因此，本发明一方面提供了一种经修饰的植物蔗糖结合蛋白，其中与相应的野生型蔗糖结合蛋白相比，经修饰的蔗糖结合蛋白具有被改变的氨基酸序列，并且与相应的野生型蔗糖结合蛋白相比，经修饰的蔗糖结合蛋白在酵母分析系统中的表达使蔗糖摄取增强。在具体实施方案中，本发明的经修饰的蔗糖结合蛋白与野生型蔗糖结合蛋白相比，在酵母分析系统中使蔗糖摄取增加至少10％，优选至少25％。在某些实施方案中，经修饰的植物蔗糖结合蛋白与野生型蔗糖结合蛋白相比，具有改变的氨基酸序列，包括C-末端截短。这种截短典型地在10-100个氨基酸之间，优选约80个氨基酸。虽然可以从任何已知的蔗糖结合蛋白中制备该经修饰的SBP，然而SBP1和SBP2的修饰形式则是本发明所举出的实例。SBP1和SBP2的修饰形式包括分别具有Seq.I.D.No.2和4所示氨基酸序列的那些形式。