[发明专利]用于植物转化的质粒和使用此质粒的方法

说明书

发明领域：

本发明涉及农杆菌介导的植物转化，特别是用T-DNA进行的植物转化，其中防止了非T-DNA载体序列的同时转移。

领域背景：

通过使用农杆菌和存在于野生型农杆菌中的Ti或Ri质粒转化植物的方法自1983年来就为人所知(如在EP 0 116 718和EP 0 120 516中)。此转化方法一般包括用提供异源基因的非致瘤性农杆菌菌株侵染植物。异源基因位于质粒上一段所谓的T-DNA中，T-DNA是位于两个24碱基对长的不完全正向重复序列即T-DNA边界之间的DNA。异源基因向植物中的转移发生在通过农杆菌和植物细胞的共培养而由酚化合物活化质粒定位的Vir基因的过程中。这些vir基因(D1和D2)在精确位点使边界重复序列产生切口，由此T-DNA在T-DNA边界处从质粒上切割下来并插入植物基因组中。

看来右边界区在T-DNA转移中最关键：删去T-DNA右边界区的Ti质粒是无毒的(Holsters，M.等，质粒3，212-230，1980)。左边界区的删除对毒性无影响(Joos，H.等，细胞32，1057-1067，1983)。

当使用双元载体系统进行转化时，需要T-DNA边界的存在，其中T-DNA位于分开的独立复制子双元载体上。

转化后，T-DNA以单一单位或串联排列的多拷贝存在于宿主植物基因组中。但是，还经常发现截短的T-DNA区(Deroles S.C.和Gardner，R.C.，植物分子生物学，11，365-377，1988)。最近，有信息表明还有边界外的DNA整合入宿主植物基因组中。据报道该现象发生在20％-30％的转基因植物中(Martineau，B.等，植物细胞6，1032-1033，1994)。但是，最近，有文献报道约75％的烟草转化体含有载体“骨架”序列(Kononov，M.E.等，植物杂志11(5)，945-957，1997)。

另一有时发生的现象是T-DNA转移在也作用为(弱)起始点的左边界起始。于是“连读”的DNA量可能变得丰富：发现有时在左边界起始的转移连读通过右边界并再次终止于左边界，导致全部双元载体的转移(Van der Graaff，E.等，植物分子生物学31，677-681，1996)。

由于只转移存在于T-DNA中的DNA是植物遗传学家的目标，因此防止两个连读机制是受欢迎的。而且，处理转基因植物和/或转基因食品(市场)注册请求的注册机构也认为转基因植物载体DNA的污染应尽可能避免。

发明概述：

本发明包括包含具有侧翼T-DNA边界的T-DNA的植物转化载体，其特征在于载体进一步包含可防止带有比T-DNA序列更多的载体序列的植物转化体形成的核酸序列。

可防止带有比T-DNA序列更多的载体序列的转化体形成的该序列是编码毒性化合物的基因，优选地选自RNA酶、DNA酶、植物毒素、白喉毒素、蛋白酶和反义管家基因如ATP合酶、细胞色素c、丙酮酸激酶、氨酰基转移酶或者磷酸、二羧酸、三羧酸和2-氧代-戊二酸转运蛋白。

上述载体的另一实施方案是防止带有T-DNA序列外的载体序列的转化体形成的序列包含结合DNA结合蛋白的序列或G+C含量高的序列。

通过用根据本发明所述的载体转化植物获得不含有T-DNA外的载体序列的转基因植物的方法也是本发明的一部分。其次，含有这样的载体的宿主如细菌、优选地农杆菌科(Agrobacteriaceae)成员、更优选地农杆菌属或根瘤杆菌属(Rhizobacterium)成员、最优选地根瘤农杆菌也构成本发明的一部分。

此外，特征在于使用根据本发明所述载体的植物转化方法也包含于本发明中。

附图简述：图1：所用构建体的图示。图2：用于检测载体序列共整合的引物杂交位置的图示。

发明详述：

基本上所有用于植物转化的已知质粒和载体都能加工成根据本发明所述的载体或在根据本发明所述的方法中可用的载体。这样的质粒的例子是pBin19(Bevan，M.，核酸研究12，8711-8721，1984)、pMOG101(WO93/10251)、pMOG800(WO95/05467)、pMON128(EP 0 131623)、GV2260(Deblaere等，1985，核酸研究13，4777-4788)、etcetera和所有从它们衍生的质粒。