[发明专利]真核细胞和反转录病毒反义起始元件

说明书

本发明的实现部分得到国立卫生研究院授予的补助金R29AI38114和RO1MH47225的政府资助。政府在本发明中享有一定权利。

发明背景

发明领域

本发明涉及真核细胞中基因表达的调节。更具体地说，本发明涉及一种新的天然的反义RNA负调节系统，该系统采用的基因元件提供了产生反义转录本的机制。

背景和相关领域描述

启动真核细胞基因的转录的一般机理通常涉及几种因子之间的相互作用，这些因子包括启动子(启动元件)、增强子、DNA结合蛋白和包含RNA聚合酶和伴随转录因子的转录复合物。通常，富含AT的区域TATA基序位于转录起始位点的上游，它是许多启动子启动RNA聚合酶有效和准确转录所必需的。在有或没有TATA盒的启动子中，启动元件可使转录因子取向于RNA聚合酶II。然而，转录的启动速率由识别转录复合物启动位点附近的启动子/增强子元件的一个或多个DNA结合蛋白来决定。据推断，DNA结合蛋白能影响转录复合物的启动或复合物一旦启动后延伸的趋势。

人免疫缺陷病毒(HIV)的5′长末端重复序列(LTR)是一种原型增强子-启动子单元，它含有一个标准的TATA盒，一个起始位点(Rittner等人，1995，J.Mol.Biol.248：562-580)、许多病毒和细胞基因中常见的上游元件(例如Sp1和NF-κB)(它们受病毒和细胞DNA结合蛋白的影响(例如参见，Jones，1989年，New Biologist 1：127-135中综述))。从HIV双链中间产物以及位于5′LTR中的HIV启动子，从负链(也称为“模板”)DNA(见本文的定义部分)转录出正链极性mRNA。然后，mRNA依赖于转录本翻译成一个或多个病毒蛋白，它们包括Gag，Pol，Vif，Tat，Vpu，Vpr，Rev，Env和Nef。

HIV启动子的有效转录取决于大幅度增加病毒mRNA水平的激活转录的Tat的存在。在没有Tat存在时，从负链DNA转录出的主要是短的mRNA转录本。这些短的转录本终止于顺式作用元件(反式激活应答区域)附近(TAR；Selby等人，1989，GenesDev.3：547-558)。另外，在Tat不存在时，转录出的是低基础水平的病毒mRNA。Tat的功能是通过位于转录起始位点下游的TAR来介导的。在转录本上的TAR区域折叠成在能量上有利的RNA次级结构或RNA-干(stem)环结构(见图1)，作为Tat的结合位点。已经证实，在Tat不存在时，已经启动了转录的大部分聚合酶提前从模板上脱离下来。在Tat结合TAR后，Tat独立于其它启动子元件起刺激延伸的作用(Rittner等人，1995，同上)。已经报道，起始元件(INR)是哺乳动物细胞中缺乏TATA盒时使转录起始有效所必需的(Javahery等人，1994，Mol.Cell Biol.14：116-127；Smale和Baltimore，1989，Cell 57：103-113)。为何HIV LTR的基础性(独立于Tat)转录在体内较低，是否有影响HIV5′LTR的某种阻遏机制存在，这些仍不能确定。

提出的一种可能是，病毒DNA的正链含有一个长的开放读框(ORF)，它位于互补于env基因序列的基因组区域中，它可能编码了一个病毒蛋白(Miller，1988，Science239：1420-142)。然而，还不清楚这种可能是否能通过(例如)证实有推定蛋白或其各自mRNA而得到确认。Michael等人进一步评价了HIV中发生双向转录的可能性(1994，J.Virol.979-87)。发现HIV 3′LTRU3区域中的一个弱的负链启动子负责产生负链极性的RNA转录本。从3′LTR中的弱负链启动子产生的这种RNA转录本在HIV生命周期中起何作用(如果有的话)仍有待阐明。