[发明专利]在植物中生产聚酮化合物

说明书

技术领域

本发明属于聚酮化合物(polyketide)合成和转基因植物生产领域。具体地说，本发明提供了制备表达一种或多种功能性聚酮化合物合成酶(PKS)和聚酮化合物的植物细胞和植物的方法。

背景技术

聚酮化合物是由不同结构天然产物组成的一个大族。聚酮化合物具有许多生物活性，其中包括抗生素特性和药理特性。例如，代表聚酮化合物的有：诸如四环素和红霉素等抗生素；包括道诺霉素在内的抗癌药物，例如FK506和雷帕霉素；例如莫能菌素和阿佛菌素等兽用产品；和诸如spinocyn(杀虫剂)和soraphen(抗真菌剂)等农用化合物。聚酮化合物在一类丝状菌，放线菌中尤其丰富。

聚酮化合物合成酶(PKS)是多功能酶，与脂肪酸合成酶(FAS)有关联。PKS催化酰基硫酯之间通过重复的(脱羧)Claisen缩合反应生物合成聚酮化合物，所述酰基通常是乙酰基、丙酰基、丙二酰基或甲基丙二酰基。随着每次缩合，通过催化、部分催化或不催化正在合成中的聚酮化合物链β酮基团上的还原循环(包括酮还原、脱水和烯酰基还原)，PKS在产物中引入了结构可变性。当碳链达到特定化合物的特有长度后，它通过硫解或酰基转移从合成酶上释放。所以，PKS是由许多族酶构成的，它们共同协作生成给定的聚酮化合物。造成天然聚酮化合物之间差异的是由各PKS基因决定的链长的有调变化，成链单元的选择和还原循环。为了具有抗生素活性，PKS催化反应生成的聚酮化合物通常需要进一步的修饰，例如糖基化。

有三类主要的PKS。其中之一称I型，“复合”或“模块化”PKS，代表性的是合成大环内酯(例如红霉素)的PKS。“模块化”PKS是一组多功能大蛋白，各自带有针对碳链组装和修饰作用各步骤的分开的活性位点(Cortes，J.等，Nature(1990)348：176；Donadio，S.等，Science(1991)252：675；MacNeil，D.J.等，Gene(1992)115：119)。这一类中的结构差异来自PKS中活性位点数量和类型的不同。这一类PKS表现出PKS基本序列活性位点数量和簇化与聚酮化合物骨架之间一对一的关联性(见图1)。

第二类PKS称II型或“芳香族”PKS，代表性的是芳香族化合物的合成酶。“芳香族”PKS一般由至少3个分开的开放读码框编码，具有一组反复使用的活性位点(Bibb，M.J.等，EMBO J.(1989)8：2727；Sherman，D.H.等，EMBOJ.(1989)8：2717；Fernandez-Moreno，M.A.等，J.Biol.Chem.(1992)267：19278)(见图2)。

第三类PKS通常称“真菌”PKS，是一种多功能蛋白，由一个读码框编码。典型的“真菌”PKS是6-甲基水杨酸合成酶(MSAS)，一般来自展青霉菌。还从构巢曲霉(Aspergillus nidulan)和葫芦科炭疽病毛盘孢(Colletotrichum lagenarium)分离到了该基因，还分离到一种催化构巢曲霉产生norsolorinic酸的PKS。Fujii，I.等，Mole Gen Genet(1996)253：1-10。所以，真菌PKS不完全附和区别于模块化PKS的芳香族PKS的分类，所以构成第三类(见图3)。

链霉菌属是一种芳香族聚酮化合物高产放线菌。在迄今研究过的各种链霉菌芳香族PKS中，碳链的组装需要3个开放读码框(ORF)的产物。ORF1编码酮基合成酶(KS)和一个酰基转移酶(AT)活性位点；ORF2编码与ORF1产物类似但没有KS和AT基序的蛋白质；ORF3编码一个独立的酰基运载蛋白(ACP)。

例如，天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)产生兰色染料聚酮化合物，放线紫素。目前已经克隆了放线紫素基因簇(act)。该基因簇编码上述PKS酶，环化酶和一系列通过后继修饰反应合成放线紫素的专用酶，以及参与抗生素输出的蛋白质和至少一种转移激活基因簇转录的蛋白质。全面调节抗生素生物合成以及提供聚酮化合物生物合成引发剂(乙酰CoA)和延伸剂(丙二酰基CoA)单元所需的其它基因位于基因组的其他位置。天蓝色链霉菌的act基因簇已经被用于在小链霉菌(S.parvulus)中产生放线紫素。Malpartida，F.等，Nature(1984)309：462。