[发明专利]酒花花叶病毒基因和用于检测酒花花叶病毒的方法

说明书

                  发明背景

发明所属技术领域

本发明涉及酒花花叶病毒的基因(此后简称为HMV)和用于检测HMV的诊断方法。

背景描述

HMV，一种酒花的病原性病毒，是一种包含单链RNA基因组的丝状病毒，并且作为酒花潜在病毒属于相同的香石竹潜病毒组。HMV是对敏感的酒花品种的花叶病症状的一种重要的病原体[Probasco和Skotland，Can.J.Microbiol.22：116011162(1976)；Adams和Barbara，应用生物学年评96：201208(1980)；Adams和Barbara，应用生物学年评101：495500(1982)；Yu和Liu，植物病理学36：3844(1987)；Kanno等，Ann.Phytopath.Soc.Japan 680(1994)]；因此，对于酒花的产生，进行了不受这一病毒污染的田块的调查和无病毒幼苗的监测。

通常，为了证实无病毒幼苗和进行田块调查以阻止病毒再感染，已经使用了免疫诊断方法，如ELISA。然而，经ELISA的HMV诊断法存在各种问题，如制备上的困难以及抗体的可用性。此外，即使抗体可供使用，ELISA仍然存在一些问题，例如由于抗体的非特异性反应产生的诊断结果的低准确度。

另一方面，由于分子生物学的最新进展使得已经阐明了各种病毒基因序列，因此可以利用基因工程技术精确地检测和诊断某些病毒物种。然而，HMV的检测依赖于以上提到的免疫学方法，因为它的基因序列还没有被阐明。

因此，本发明的发明人曾积极努力分离和纯化HMV基因，并且阐明它的碱基序列。此外，他们已经开发了利用这样的核酸序列检测HMV的方法。

                      发明概要

正如以上所描述的，本发明提供了酒花花叶病毒的基因或包含其部分序列(即HMV基因的片段)的核酸。

这些分离的与纯化的(例如，合成的)核酸使得可以利用遗传学方法在酒花种苗内和田块中检测病毒的存在。例如，采用这些核酸，遗传学方法(如PCR，杂交方法等)使得可以以一种高度精确的方式检测微小量的病毒。

以上描述的核酸可以从酒花花叶病毒的基因组RNA或其对应的cDNA制备。

上述酒花花叶病毒cDNA的碱基序列与SEQ ID NO：1中所显示的碱基1-1844完全相同，或者与该序列是基本上相同的序列。本文中术语″基本上相同的序列″指利用遗传学检测方法(例如杂交方法等)可以用来检测酒花花叶病毒的序列，包括与SEQ ID NO：1的序列可杂交的那些序列。即这样的与SEQ ID NO：1之序列基本上相同的序列可以利用上述SEQ ID NO：1中所示的核酸经遗传学方法(例如杂交方法等)制备。优选地，这些序列是在下文所描述的条件下可杂交的。

此外，可以优选地利用上述的部分序列，例如，编码病毒颗粒和外被蛋白质等的构成物的基因区。更具体地说，可以利用编码由525-1445位碱基编码的306个氨基酸残基的、编码由1445-1753位碱基编码的102个氨基酸残基的、或者编码由302-508位碱基编码的68个氨基酸残基的SEQ ID NO：1序列。在其中它们用作PCR法的引物和杂交法的探针的情况下，尽管为了利用这些部分序列可以使用以上所述的全长序列，但是在病毒检测中可以选择包含至少15个碱基及合适长度的区域。例如，为了用作PCR法的引物和杂交法的探针，优选地采用SEQ ID NO：2和3中所示的碱基序列。本发明也包括以下任何DNA序列：其编码由SEQ IDNO：1的525-1445位碱基编码的306个氨基酸残基、编码由SEQ ID NO：1的1445-1753位碱基编码的102个氨基酸残基、或者编码由SEQ ID NO：1的302-508位碱基编码的68个氨基酸残基。

此外，本发明提供了通过采用上述纯化的核酸的筛选遗传学方法检测酒花样品内酒花花叶病毒，以证实其是否由这一病毒污染的方法。