[发明专利]用来自分化细胞的供体核克隆猪的方法

说明书

1.发明领域

本发明涉及将来自分化的猪细胞的细胞核移植入与供体核相同物种的去核的哺乳动物卵母细胞的克隆方法。核得到程序重排以指导克隆胚的发育，然后将克隆胚转移到雌性受体中产生胎儿和子代，或将其用于产生培养的内细胞团细胞(CICM)。克隆胚也可用于与受精胚结合产生嵌合胚、胎儿和/或子代。

2.发明背景

已有报道使用有蹄动物的内细胞群(ICM)细胞进行核移植。例如，Collas等在Mol.Reprod.Dev.38：264-267(1994)中公开了通过将裂解的供体细胞显微注射入去核的成熟卵母细胞进行牛ICMs的核移植。Collas等公开了将胚在体外培养七天产生的十五个胚细胞转移入牛受体时使其中四头怀孕及两头生产。并且，Keefer等在Biol.Reprod.，50：935-939(1994)中公开了在核转移方法中将牛的ICM细胞作为供体核产生的胚细胞移植入牛的受体时，产生了一些可存活的子代。并且，Sims等在美国国家科学院院报90：6143-6147(1993)中公开了通过将在体外短期培养的牛ICM细胞的核转移入去核的成熟卵母细胞可生产小牛。

也有报道称转移培养的胎盘细胞的核后可产生能存活的小羊(Campbell等，自然，380：64-68(1996))。更进一步地，核转移中牛多能胚细胞的使用和嵌合胎儿的产生已有报道(stice等，Biol.Reprod，54：100-110(1996)；Collas等，Mol.Reprod.Dev.，38：264-267(1994))。Collas等证明肉芽肿细胞(成体细胞)可用于牛克隆方法中以产生胚。但是，未能证明其发育可超过早期胚阶段(胚泡阶段)。并且，肉芽肿细胞不易培养并仅能从雌性获得。Collas等未尝试在培养中繁殖肉芽肿细胞或试图遗传修饰那些细胞。Wilmut等(自然，365：810-813(1997))从胎儿成纤维细胞产生核转移绵羊子代，从成体绵羊细胞也产生一个子代。

         克隆猪细胞与其它物种的细胞相比更为困难。

                  此现象可由下表进行说明：

物种(从最难克隆到最易克隆的)    克隆的细胞类型  产生的子代猪(Prather，1989)2和4细胞阶段的胚是猪(Prather，1989；Liu等，1995)大于4细胞的阶段否小鼠(Cheong等，1993)2、4和8细胞阶段的胚是小鼠(Tsunoda等，1993)大于8细胞的阶段否牛(Keefer等，1994)64到128细胞的阶段(ICM)是牛(Stice等，1996)来自ICM的胚细胞系否绵羊(Smith等，1989)64到128细胞的阶段(ICM)是绵羊(Campbell等，1996)来自ICM的胚细胞系是绵羊(Wilmut等，1997)胎儿和成体细胞是