[发明专利]通过发酵生产L－丝氨酸的方法

说明书

本发明涉及用于制备药物、化学药品和化妆品领域中所用氨基酸混合物的L-丝氨酸的生产方法、构成本方法的棒杆菌、D-3-磷酸甘油酸脱氢酶(下文有时称为“3-PGDH”)和编码该3-PGDH的DNA。

作为通过发酵制各L-丝氨酸的常规方法，已报导这样一种方法，即其中能够将甘氨酸和糖转化成L-丝氨酸的细菌菌株在含有30g/L甘氨酸的培养基中用于生产至多14g/L的L-丝氨酸。通过该方法将甘氨酸转化成L-丝氨酸的产量达到46％(KubotaK.农业生物化学，49,7-12(1985))。用能够将甘氨酸和甲醇转换成L-丝氨酸的细菌菌株，可从100g/L的甘氨酸中生产出53g/L的L-丝氨酸(T.Yoshida等，发酵和生物工程杂志，79卷，第2期，181-183,1995)。在使用诺卡氏菌属细菌的方法中，已知可通过培养那些对氧肟酸盐、重氮丝氨酸等具有抗性的菌株而提高该细菌L-丝氨酸的生产力(日本专利公开No.57-1235)。然而，这些方法包括使用作为L-丝氨酸前体的甘氨酸并且包括复杂的操作且从费用的角度也是不利的。

作为可直接从糖发酵L-丝氨酸并且无需在培养基中添加L-丝氨酸前体的菌株，已知有谷氨酸棒杆菌，该菌对D-丝氨酸、α-甲基丝氨酸、O-甲基丝氨酸、异丝氨酸(isoserine)、丝氨酸氧肟酸盐和3-氯丙氨酸具有抗性但是L-丝氨酸的积累低达0.8g/L(Nogei Kagakukaishi,48卷第3期，p201-208,1974)。因此，有必要进一步改进菌株以用于工业规模L-丝氨酸的直接发酵。

另一方面，关于棒杆菌，已经公开了能够在细胞中自主复制并且具有药物抗性标记基因的质粒(参考美国专利4,514,502)和将基因导入该细胞中的方法(公开的日本专利申请No.2-207791)和培养产生L-苏氨酸或L-异亮氨酸细菌的可能性(美国专利4,452,890和4,442,208)。同样，有关产生L-赖氨酸细菌的培养，已知一种包括掺入参与L-赖氨酸生物合成的基因至质粒载体中并在细胞中扩增该质粒的技术(公开的日本专利申请No.56-160997)。

在大肠杆菌的情况中，参与L-丝氨酸生物合成的酶包括相对于野生型中L-丝氨酸生产而言对反馈抑制敏感的酶并且已知有这样一种实例，即其中导入突变基因从而可对反馈抑制脱敏而导致L-丝氨酸的增加(日本专利No.2584409)。作为这种基因，具体地已知有3-PGDH基因(下文，编码3-PGDH蛋白的基因也将称为“SerA”)。

此外，在棒杆菌的情况中，已知有这样的实例，即其中3-PGDH基因的扩增影响了L-色氨酸的生产力(公开的日本专利申请No.3-7591)。

本发明的目的是提供将糖转变为L-丝氨酸的微生物并且提供了利用微生物将糖转变为L-丝氨酸的能力在培养基中积累L-丝氨酸的方法，即在工业规模的实践中优越的生产L-丝氨酸的方法。

由于为了达到上述目的而对L-丝氨酸生产方法进行了深入的研究，结果，本发明者现已发现筛选具有L-丝氨酸生产力的棒杆菌，特别优选的是来自棒杆菌菌株，显示出对重氮丝氨酸或β-(2-噻吩)-DL-丙氨酸具有抗性但L-丝氨酸分解活性具有缺陷的突变菌株作为亲本菌株并且用此筛选出的菌株进行L-丝氨酸发酵将大幅度增加L-丝氨酸的积累。根据此发现完成了本发明。

即，本发明涉及对重氮丝氨酸或β-(2-噻吩)-DL-丙氨酸具有抗性并且具有L-丝氨酸生产力的棒杆菌。

此外，本发明涉及来自其中对L-丝氨酸的反馈抑制被脱敏的棒杆菌的D-3-磷酸甘油酸脱氢酶；可以从对重氮丝氨酸或β-(2-噻吩)-DL-丙氨酸具有抗性并且具有L-丝氨酸生产力的棒杆菌获得的上述D-3-磷酸甘油酸脱氢酶；具有序列表中SEQ ID:12中列出氨基酸序列或包括一个或更多个氨基酸替代、添加或缺失并且其中的相应于SEQ ID:12氨基酸序列中第325个谷氨酸残基的氨基酸被非谷氨酸的氨基酸替代的氨基酸序列的D-3-磷酸甘油酸脱氢酶；和具有在序列表SEQ ID NO:11中列出序列的上述D-3-磷酸甘油酸脱氢酶。

更进一步，本发明涉及编码上述D-3-磷酸甘油酸脱氢酶的DNA和具有在序列表中SEQ ID NO:13中列出碱基序列的上述DNA。

更进一步，本发明涉及带有含上述DNA的重组DNA的棒杆菌。

此外，本发明涉及生产L-丝氨酸的方法，包括在培养基中培养上述细菌从而使L-丝氨酸在培养基中积累并且从该培养基中收集L-丝氨酸的步骤。