[发明专利]牛FcγRI、FcγRⅢ和CD14的cDNA序列

说明书

本发明属于分子和细胞生物学领域，涉及牛的DNA序列，特别是涉及对牛FcγRI，FcγRIII和CD14的cDNA序列分析。众所周知，人和动物对病原体的抵抗力(免疫力)有特异性和非特异性之分，采取一些人为的措施和手段例如接种疫苗，注射免疫球蛋白，服用中草药免疫增强剂等都可以引起机体的免疫反应，从而达到提高人和动物的免疫能力的目的。免疫反应包括细胞免疫和体液免疫两种应答形式。当机体遇到病原细菌感染时，即产生以抗体为主的体液免疫；若人和动物体遇到病毒、霉形体或寄生虫等病原体感染时，产生以细胞因子为主的细胞免疫应答，但二者不是单独作用，而是相辅相成并有机地结合在一起，共同对付病原体。事实证明，免疫球蛋白G(IgG)是抗体的主要成份，当体内免疫反应启动时，IgG通过与细胞表面的Fc受体结合，激活靶细胞，使后者产生并释放细胞因子及其它活性物质，诱发机体一系列免疫反应，最终将病原体杀死或清除。由此看来，存在于白细胞表面的IgG的Fc受体在机体的免疫反应中扮演着极其重要的角色。

免疫球蛋白G的Fc受体(FcγR)包括牛FcγRI、FcγRII和FcγRIII，它们分别被称为CD64、CD32和CD16。其主要功能是参与机体对异物的识别和清除，ADCC、抗原的处理和提呈、抗体和细胞因子产生的调控及信号转导等，在机体细胞免疫和体液免疫中起桥梁作用。CD14为革兰氏阴性细菌细胞壁主要成份脂多糖(LPS)及脂多糖结合蛋白复合物(LBP)的受体，也是一种白细胞分化抗原，它在机体细胞因子产生调控方面，尤其在病原体为革兰氏阴性菌的疾病的发生、发展和转归方面起着重要作用。因此，研究这些受体和CD14的结构不但在理论上有助于理解其结构与功能关系，阐明它在体内的作用机制，还可以从实践中进一步探索提高机体免疫能力的方法。

近年来对IgG Fc受体的研究已成为分子免疫学领域中的研究热点。据我们查新检索，与本研究相关的文献国外有3篇，国内尚无此类报道。1992年英国学者Symons用分子杂交方法获得了牛FcγRI的部分编码基因(约0.7kb)，但不是全长基因，未能反映出FcγRI的全部基因结构；另外，Collins等英国学者在1997年发表了用RT-PCR方法获得来源于牛肠系膜淋巴结单核细胞的牛FcγRIII的编码基因，全长为0.75kb，我们获得的牛FcγRIII的编码基因为0.5kb，和Collins等报道的差异较大，可能属于另一类型；日本学者Ikeda等在1997年发表了牛CD14的全长基因序列，但他们是从染色体基因中获得的，在其编码序列中含有内含子，我们是从反转录后的cDNA文库中调取的编码牛CD14的全长基因，不含有内含子，更能反映牛CD14mRNA的真实结构。

本发明的目的在于：以牛做为反刍动物的代表对其IgG Fc受体FcγRI、FcγRIII及CD14的编码基因进行克隆和序列分析。

本发明的技术方案是：用健康牛的肺巨噬细胞构建牛的cDNA文库，采用标记磁微粒技术结合PCR方法对构建的牛肺巨噬细胞cDNA文库进行筛选，分别克隆到了牛的FcγRI，FcγRIII和CD14的编码基因。

其具体的做法是：

(1)首先构建牛的cDNA文库。用PBS将肺泡中的巨噬细胞洗出，用尼龙膜过滤除去沉淀后制成细胞悬液，用CsCl作垫层进行超速离心以提取牛肺巨噬细胞的总RNA，再用OLIGO(dT)柱层析方法分离出mRNA，用随机引物将提取的mRNA反转录为cDNA。加T4DNA聚合酶补平，再将含有BstXI酶切质粒pCDM8，回收大片段，然后用修饰过的cDNA与pCDM8大片段连接，转化大肠杆菌MC1061/P3，构成牛的cDNA文库。

(2)将一定数量的COS-7细胞铺到培养板中，37℃培养至50％连成片时(约24h)，每孔各加进一定量的牛肺巨噬细胞cDNA文库和转染试剂。转染24h后，倒掉培养液，用不含血清的DMEM洗一次，加EDTA消化COS-7细胞，并收集到离心管中。

(3)分别用鸡的卵清蛋白或抗牛CD14单克隆抗体按要求标记磁微粒。取适量标记磁微粒加到所收集的COS-7细胞中，混匀并在室温下孵育，将管子放在一块磁铁上片刻，待磁微粒沉淀后弃上清，重复洗3次，然后提取沉淀细胞中的质粒DNA，转化大肠杆菌。

(4)参考牛FcγRI和FcγRIII的已知基因片段序列，以及人和小鼠CD14基因中的保守序列，用引物分析软件设计一对引物，随机挑取转化子，按每10个为一组，混合培养后提取质粒DNA并进行PCR扩增，待有特异性DNA条带时，再用PCR扩增该组的单个菌落的质粒DNA，直到筛选到单个的阳性菌落为止。