[发明专利]马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒疫苗株的全长基因序列

说明书

本发明属于病毒学和分子生物学专业领域，涉及对一种慢病毒疫苗株的全长基因序列的发现，确切地说是阐明我国成功研制的用于控制马传染性贫血病的减毒活疫苗毒株的全基因结构和序列、其编码蛋白质的序列以及它们的应用范围。

马传染性贫血病毒(Equine Infectious Anemia Virus，EIAV)是引起马属动物发生传染性贫血症病原体，对畜牧业具有巨大危害，是兽医界颇受重视的病原体之一。EIAV属逆转录病毒科慢病毒属(lentivirus)，与同属于慢病毒属的人类免疫缺陷病毒(Human ImmunodificiencvVirus，HIV)在基因组结构，基因编码蛋白以及基因调控方式等方面有许多相似之处(J.M.Coffin，The Structure And Classification of Retroviruses，in：TheRetroviridae，Vol.1，p19，edited by J.A.Levy，Plenum press)。由于EIAV是最早发现的动物病毒之一和最先发现的慢病毒，其基因高度变异引起慢性迁延性的疾病和自身免疫性病理，从而成为研究慢病毒感染、免疫病理、病毒酶功能以及免疫保护机理的重要动物模型(R.C.Montelaro et，al Equine Retroviruses，In：vol.2，P.257)。

我国自六十年代起投入巨资对该病毒的生物学性状进行了研究，分离并培育出与国外EIAV毒株有明显生物学差异的强毒株并进行了体外驴白细胞传代。经过多年努力，逐步驯化了该病毒并使之成为无致病力，但可以使动物在接种之后产生免疫保护的疫苗株。该疫苗株自1976年开始生产，1978年在全国大规模应用(沈荣显等，马传染性贫血免疫的研究。中国农业科学，第4期P1-15，1979)。至今已接种7000万匹次的马、骡、驴，完全控制了该病在我国的流行。

对病毒基因组的研究是在70年代分子生物学技术发展并得到广泛应用之后才兴起的。现在GenBank中已发表的马传染性贫血病毒的基因组序列均来源于美国强毒株(Wyoming株)和日本强毒株(Goshun株)，以及由它们衍生得到的细胞培养适应株的基因序列。然而这些毒株均不是疫苗毒株。我国研制成功的EIAV弱毒疫苗至今还是目前世界上唯一经过大规模应用、长时间检验而被证明是安全和有效的慢病毒疫苗(R.C.Montelaro，et al.in：Vaccines against Retroviruses，Vol.4，P605，R.C.Montelaro et，al Equine Retroviruses，in：vol.2，P.257)。由于我国的马传染性贫血疫苗毒株是由经典路线制造出的，其基因组序列尚未被阐明。这一方面不能从基因水平上保护我国的EIAV疫苗的知识产权，另一方面也限制了该疫苗模型对其他慢病毒疫苗研制的指导作用。

本发明的任务在于阐明一种能有效保护马属动物免于患马传染性贫血病的EIAV弱毒活疫苗株的全基因的结构和核苷酸序列及由其编码蛋白的结构和氨基酸序列，保护我国自主知识产权。同时经过将EIAV弱毒疫苗基因序列和蛋白结构与EIAV强毒株进行对比，揭示该疫苗毒株在传代过程中毒力减弱的分子机理和其诱导保护性免疫的组分和机理，从而为至今尚未突破的包括HIV在内的其他慢病毒疫苗的研究提供重要的参考。该发明可直接指导艾滋病疫苗和其它慢病毒疫苗的研制，进一步研究该疫苗毒株及其各主要基因和所编码的蛋白质可分别用于EIAV疫苗株和EIAV强毒株的核酸鉴别诊断和血清学鉴别诊断试剂的研制，并且用其构建的载体还可用于基因治疗。

本发明是通过以下技术手段实现的：首先用PCR方法扩增EIAV疫苗株的基因，分别克隆到质粒载体中再进行DNA序列的分析，得到该病毒的全长基因序列。