[发明专利]长期贮存花粉活性的方法

说明书

本发明涉及一种长期储存花粉活性的方法，具体地是有关采用浸油冷冻方法长期储存花粉，并由油滴悬浮花粉管萌芽法证实经该法长期储存的花粉在短时间内实现花粉管萌芽。

以往花农欲培植花卉，须靠花朵的花粉传粉受精结成种子，再取种子培育，但花朵的花粉常因受天候、田地养分及土壤含菌(如枯草杆菌等)等天然因素影响，并不容易受精成种子。为解决花粉可受精结成种子的难题，乃有各种贮存花粉方法使之不受天然因素影响。目前实验室贮存动物细胞或植物无壁细胞最常采用的方法有二甲亚砜(DMSO)/冻结法，但此法若应用于花粉的贮存时，对花粉的伤害甚大，故并不适合贮存花粉。另外若以贮存细菌及霉菌所用的50v/v％甘油溶液/冻结方法，亦对保存花粉活性不适合。

有鉴于此，本发明人为解决花粉受精结成种子的培植问题，避免花粉受天然因素影响，乃思长期贮存花粉活性的方法，本发明人由野姜花及百合花在自然界环境未授粉前含有大量精油之现象获得启示，经精心研究发现采用植物油及在低温操作的浸油冷冻法贮存花粉后，并以油滴悬浮花粉管萌芽法使花粉在短时间内萌芽，证实采用浸油冷冻法可近乎无限期存活花粉，以至完成本发明。

本发明的目的之一在于研究提供一种长期贮存花粉活性的方法，即浸油冻结长期储存花粉的方法，花粉在长期储存中活性不会受天然因素的影响而损失。

本发明目的之二在于提供一种长期贮存花粉活性的方法，同时在培养液内加入少许电解质降低对糖分的依赖度，解决一般习用洋菜培养基的问题，提供经浸油冷冻后的花粉可顺利萌管发芽的环境。

本发明的目的之三在于提供一种长期贮存花粉活性的方法，同时研究提供一种测试经浸油冻结长期贮存后的花粉存活状况的方法，证实本发明方法的可行性。

本发明提供的长期贮存花粉活性的方法，是采用植物油及低温提取的浸油冷冻贮存花粉，亦即将成熟花粉分散于选自由色拉油、葵花子油、红花油、植物精油及维他命E而成的群体至少一种低熔点植物油内，于低温冻结后取出，在5～80℃温度范围于选自C98培养液、E98培养液及G98培养液的群体之至少一培养液中培育而成，然后以油滴悬浮花粉萌芽方式使经浸油冷冻后的花粉在含有少许电解质的C98培养液中短时间内萌芽，证实采用本发明方法可近乎无限期存活花粉，亦即花粉经浸油冻结贮存后，取出以油滴悬浮花粉管萌芽(drifted droplet pollen germination，以下简称DDPG)在不用显微镜短时间且成本经济的条件下以肉眼观察出花粉管萌芽，证实采用植物油及在低温操作的浸油冷冻法可长期存活花粉。

上述植物油，是本发明人如前述在姜花及百合花粉在自然环境下授粉前含有大量精油获得启示，乃由采用植物油及适当溶剂以模拟精油着手，以至完成本发明。通常溶剂有三类，第一种为常用于细胞贮存的溶剂如DMSO(二甲基亚砜)、甘油等；第二种为清洁剂类，如软性直链式烷基苯磺酸(LinearAlkyl Benzene Sulfonate，LAS)，辛基葡糖苷(OG或octylglucoside)，Crematophore等，其中OG为较不损伤细胞膜蛋白质的清洁剂；第三种为挥发性有机溶剂，如氨(ammonia)、二甲基胺(dimethyl aminc)、酚(phenol)、甲苯(toluene)，吡啶丙酮(pyridine acetone)、丁酸(butyric acid)。一般以5％DMSO+10％ glucose(葡萄糖)最常用在植物无胞之原生质膜细胞的贮存上，但花粉在常温下接触5％DMSO再经离心去除溶液后与葡萄糖溶液再混合，已完全丧失发芽存活能力，故并不适合。又采用50v/v％甘油水溶液虽未立即造成花粉受损，但在-8℃的慢速冷却过程中会造成98％以上花粉死亡，又在-135℃急冷过程中，花粉全部死亡。为此本发明人乃采用并筛选出低熔点植物油，发现三个不同低熔点植物油般物质，例如大豆色拉油、精油及合成维他命E油均在-80℃冻结贮存后显现优越的保护花粉的能力(亦即经长期油浸冻结的花粉，仍具萌管发芽能力)。