[发明专利]流行性出血热原代地鼠肾细胞多价纯化疫苗

说明书

本发明属生物制药领域，涉及流行性出血热疫苗，特别是涉及应用GHKC为细胞基质和以适应于GHKC的EHF病毒株为毒种，生产流行性出血热多价疫苗及纯化的方法。

流行性出血热(EHF)国际上称肾综合征出血热(HFRS)，是以鼠类作为传播媒介的自然疫源性疾病，是一种严重危害人民健康的病毒性急性传染病。近年来，全世界每年有约15万病例，死亡率达3％～10％。流行疫区在不断扩大，重症型疫区主要发生在亚洲和歇洲东部，轻症型遍及全世界。在中国，已有28个省，市、自治区有本病的发生和不同程度的流行，1986年曾发生11万病例，对人民的健康、生命安全和国民经济的发展均造成严重影响。为此，对疫区高危人群和将进入疫区工作或旅游的人们进行特异性免疫接种，是降低发病率，有效控制本病暴发流行的根本途径。

自1978年韩国李镐汪等首次成功地分离到肾综合征出血热病毒以后(Lee HW,et al,Infect Dis,1978.137,298)，国内外许多研究者都着手进行流行性出血热疫苗的研究。韩国李镐汪首先研制出乳鼠脑纯化疫苗(LeeHW.et al,Archvirol,1990 [supplⅠ],35)，朝鲜金洛济等研制出白鼠和地鼠乳鼠脑纯化疫苗(金洛济等，中华实验和临床病毒学杂志，1991,5,487)，我国在流行性出血热疫苗研究方面进展也较快。兰州生研所用分离自黑线姬鼠的LR₁株(Ⅰ型)病毒研制出鼠脑纯化疫苗(孙柱臣等，中国媒介生物学及控制杂志，1992.3<特刊7期>,203).上海生研所和浙江省防疫站用分离自病人血清的Z₁₀株(Ⅰ型)病霉研制出长瓜沙鼠肾细胞疫苗(朱智勇等，中国媒介生物学及控制杂志，1992.3<特刊7期>,279)，流研所用分离自黑线姬鼠的A₁₆株(Ⅰ型)病毒研制了鸡胚细胞疫苗(严玉臣等，中国媒介生物学及控制杂志，1992,3,166)，长春生研所和中国预防医学科学院病毒学研究所用分离自罗赛鼠的L99株(Ⅱ型)病毒研制出地鼠肾细胞疫苗(宋干、黄永成等，病毒学报，1991,7(2),102～106)，但上述的疫苗均是单价疫苗(Ⅰ型或Ⅱ型)，而我国多数是以Ⅰ型或Ⅱ型为主的混合型疫区。

1995年5月，世界卫生组织(WHO)在芬兰赫尔辛基召开了汉坦病毒疫苗研制会议，会议提出“汉坦病毒疫苗的最终目标应是一种能防御各种致病汉坦病毒的多价疫苗”(《国外医学》预防、诊断、治疗用生物制品分册，1997,20(1),27)，韩国从l993年开始用Ⅰ型疫苗和Ⅲ型疫苗(普马拉病毒、PUUV)联合研究双价疫苗，但未见人体临床观察的报道。1993年，我国宋干、黄永成等研制出包括出血热Ⅰ型和Ⅱ型的地鼠肾细胞双价疫苗(宋干等，病毒学报，l993,9(2),144～l51),1997年浙江省防疫站和杭州天元生物药业公司联合研制出原代沙鼠肾细胞(Ⅰ型、Ⅱ型)双价疫苗(董关木，中国公共卫生，1997,13(8),451)，这两种疫苗均含较多的细胞杂蛋白。

本发明的主要目的是提供一种以金黄地鼠肾细胞作为感染病毒的细胞基质，以适应于GHKC的流行性出血热病霉JR-C-1,PS₆和L₉₉为毒种，制备流行性出血热双价(或多价)灭活疫苗的方法。该方法包括地鼠肾单层细胞的制备，用已知病毒JR-C-1,PS₆和L₃₉感染地鼠肾细胞，收获病毒液和疫苗配制等。

本发明另一个主要目的是提供一种对流行性出血热双价(或多价)灭活疫苗半成品进行纯化的方法，该方法是将半成品疫苗液经高速离心，盐析沉淀，超滤浓缩和柱层析等步骤进行纯化。

本发明的最终目的是提供一种抗原性广谱，抗原含量高，已去除大部分细胞杂蛋白，适合于全国各EHF疫区使用，并且十分安全有效的流行性出血热多价纯化疫苗。

一．流行性出血热疫苗毒种的制备