[发明专利]肌醇六磷酸酶制剂

说明书

本发明涉及液体和干燥的肌醇六磷酸酶制剂，其具有通过稳定剂的添加或通过交联而获得的增强的稳定性、优选地热稳定性。

尽管在饲料中存在大量肌醇六磷酸磷形式的磷酸盐，但单胃动物象猪和家禽缺乏利用这种形式的磷酸盐的能力。肌醇六磷酸的碱或碱土盐主要天然存在于谷类中。由于单胃动物不能利用这种形式的磷酸盐，所以通常将磷酸盐加入动物饲料中。

另一方面，已知一种称为肌醇六磷酸酶的酶(肌性肌醇六磷酸磷酸水解酶)存在于植物和某些微生物中。肌醇六磷酸酶能通过发酵产生，本领域已知使用肌醇六磷酸酶作为一种动物饲料添加剂，以通过无机磷酸从肌醇六磷酸(肌性肌醇六磷酸)中的释放来提高植物材料的营养价值。通过向动物饲料中添加肌醇六磷酸酶，能降低环境磷污染的水平，因为动物能利用通过肌醇六磷酸酶的应用而从肌醇六磷酸释放的磷酸。

对于饲料应用，一种稳定的优选地热稳定的肌醇六磷酸酶是被普遍关注的，以避免可在配制(例如喷雾干燥、造粒)和饲料加工过程(例如造粒、挤出、膨化)中发生的问题，其间暂时的高温(高达80-120℃)和剪切应力可影响蛋白质的结构并导致所不希望的活性丧失。

Gist-Brocades的国际专利申请WO 93/16175描述了肌醇六磷酸酶的稳定的液体制剂。建议使用尿素和水溶性的多元醇作为稳定剂，由此提到山梨糖醇、甘油和分子量为6000的聚乙二醇。

本发明的一个目的是提高肌醇六磷酸酶的稳定性优选地热稳定性，稳定性被定义为在不同条件下保留活性的能力。该稳定性方面涉及酶的完整的生命周期，包括产生(饲料的发酵、下游加工、配制和热处理)、分配(运输和贮存)和最终应用。对于商业上感兴趣的酶如肌醇六磷酸酶，重要的是在不同的饲料加工过程如造粒、挤出和膨化中耐受所达到的高温(高达80-120℃)，并且在长期贮存中稳定。

本发明中使用的术语“稳定性”涉及一种工业酶的所有特性，包括如活性、特异性、贮存稳定性、机械稳定性、微生物稳定性、毒性、化学组成和物理参数如密度、粘度、潮解性以及颜色、气味和粉尘等方面。本发明的一个优选的方面涉及肌醇六磷酸酶在配制和饲料加工过程如造粒、挤出和膨化中耐受加热灭活的稳定性。    

肌醇六磷酸酶广泛应用的一个主要障碍是这些酶在饲料加工过程中耐受灭活所需的热稳定性(80-120℃)的限制。当前可获得的工业化肌醇六磷酸酶全部来源于黑曲霉(A.niger)，对加热灭活具有低的固有耐受力。作为一种选择性或除分子生物学方法之外的方法，本发明通过不同添加剂的添加，以及另一方面通过酶单体化学交联为寡聚体，提高了蛋白质的稳定性优选地热稳定性。

也用所谓的共有肌醇六磷酸酶进行导致本发明的实验，该酶是根据一种理论分子生物学方法开发的肌醇六磷酸酶，与曲霉(Aspergillus)肌醇六磷酸酶相比具有较高的固有稳定性，见欧洲专利申请公开文本897 985。在本发明的实施中，也能使用在实施例3-13中详细描述的共有肌醇六磷酸酶。

本发明公开了不同添加剂的应用，它们作为稳定剂对酶的稳定性优选地热稳定性起作用。

关于能在本发明中优选使用的非配制肌醇六磷酸酶比活性的温度依赖性，根据它们的最大活性能形成三个不同组。在如下温度时达到最大活性：对于烟曲霉(A.fumigatus)和黑曲霉肌醇六磷酸酶在55℃，土曲霉(A.terreus)CBS和构巢曲霉(A.nidulans)肌醇六磷酸酶在45℃，共有肌醇六磷酸酶在65℃。选择所测最高温度以上10-15℃的温度(此时非配制的肌醇六磷酸酶完全失活)作为筛选点，用于研究稳定剂对肌醇六磷酸酶热稳定性的作用，即对于构巢曲霉和土曲霉CBS肌醇六磷酸酶为60℃，黑曲霉和烟曲霉肌醇六磷酸酶为65℃，共有肌醇六磷酸酶为75℃。

本发明提供一种稳定的、优选地热稳定的酶制剂，它包含肌醇六磷酸酶和至少一种稳定剂，该稳定剂选自：

a)包含5个碳原子的多元醇，优选地是C₅糖，更优选地是木糖醇和核糖醇，

b)分子量为600到4000Da的聚乙二醇，

c)丙二酸、戊二酸和琥珀酸的二钠盐，

d)羧甲基纤维素，和

e)藻酸钠

本发明也提供一种稳定的、优选地热稳定的酶制剂，它包含通过以下方法交联的肌醇六磷酸酶；

a)通过与戊二醛的化学反应；或通过

b)高碘酸钠的氧化和随后己二酸二酰肼的加入