[发明专利]利用水禽制备多株抗体的方法

说明书

本发明涉及一种利用免疫反应制备抗体的方法，特别是涉及利用水禽类为中间宿主制备多株抗体的方法。

多株抗体(polyclonal antibldy)是免疫学检验试剂中最重要的部分。现今已广泛应用于各项生物医学领域。以往多株抗体的制备皆利用哺乳类动物(如小白鼠、兔子、牛、羊等)而制得。然而，生物种差(Phylogenetic distance)之故，通常需要大量抗原方可产生理想的抗体，但以此种方法所得的多株抗体所制成的免疫检验试剂于临床应用时，多有产生假阳性反应(false positive)之困扰。此反应的产生主要原因是所得的抗体(动物血清中的IgG)与检体(人体血清中的IgG)其来源同为哺乳类动物，具有生物学上所谓的同质性(homogenecity)所致，尤其当人体具有自体免疫性疾病(autoimmune disease)时，比如有类风湿性因子(Rheumatoid factor)存在时，更易造成此种假阳性反应的干扰。近年来国外以蛋鸡(飞禽类)为免疫中间宿主，自其产蛋中制得多株抗体。发现因生物种差较远，在临床应用上已可将假阳性反应的干扰降至最低。并且若以人体蛋白为抗原时也因生物种差较远，而有较好的免疫性。由于台湾在养鸭及其各项产品加工等产业方面相当发达，本发明主要利用蛋鸭(水禽类)取代蛋鸡为中间宿主，产生多株抗体以达广泛应用之目的。

本发明的目的，在于提供一种利用水禽为中间宿主制备多株抗体的方法，此抗体具有高特异性(specificity)及稀释能力，更可有效避免假阳性反应。此种方法与以蛋鸡为中间宿主比较的优点在于：1、蛋鸡的免疫反应仅及蛋鸭的1/3；2、鸭蛋的重量为鸡蛋的一至二倍，此意味着可产生一至二倍的多株抗体；3、蛋鸭的死亡率远较蛋鸡为低，此为本发明的特殊之处。

本发明涉及一种利用水禽制备多株抗体的方法，其包括：

(a)以纯化的抗原(免疫原)注射至水禽；

(b)再以不完全佐剂进行加强反应；

(c)5-15天后，水禽的产蛋中即有多株抗体产生。

在本发明所述的利用水禽制备多株抗体的方法中，其中所述的注射包括肌肉、皮下、皮内、血管注射等方法；所述的水禽选自母鸭、母鹅；所述的抗原包括人体免疫球蛋白；

在本发明所述的利用水禽制备多株抗体的方法中，其中所述的抗原选自：

(a)来自哺乳类动物的蛋白质、荷尔蒙；

(b)各种病毒；

(c)细菌；

(d)以基因工程制备得到的重组蛋白、合成肽(syntheticpeptide)；

(e)各种治疗用药、药物滥用药品的蛋白质结合物。

本发明涉及一种多株抗体，其特征在于，它是利用包括上述步骤(a)-(c)的方法所制备。

本发明还涉及所述的多株抗体的用途，其应用于各种临床免疫检测试剂及研究用免疫试剂的制备以及食品饲料中。

本发明进一步涉及一种自水禽产蛋中纯化多株抗体的方法，其包括：

(1)以水为溶剂，自该产蛋的蛋黄中粗分离IgY，可使用自来水、纯化蒸馏水、去离子水，或为PH≥5.1的微酸或含0.05％以下的非离子洗涤剂(non-ionic detergent)水溶液或0.15-1.0M食盐水溶液，磷酸盐缓冲液或三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Tris-buffer)等；

(2)添加硫酸铵，使达30-50％的饱和度，或添加硫酸钠，使达14-20％(W/V)的浓度，在其浓度下重复进行盐析；

(3)使用含疏水基胶体(hydrophobic ligand coupled tomatrices)进行层析IgY：

(a)所述的疏水基胶体选自：

丁基琼脂糖(Butyl sepharose)、辛基琼脂糖(Octylsepharose)、苯基琼脂糖(Phenyl sepharose)、烷基琼脂糖(Alkylsepharose)、甲基丙烯酸甲酯(Methyl methacrylate)和甲基丙烯酸丁基酯(T-Butyl methacrylate)；

(b)层析管柱的操作条件：

(i)管柱平衡缓冲液在PH7.0-8.0；

(ii)平衡缓冲液为1.0M的硫酸铵或硫酸钠，其电导度为110-200ms/ml；

(iii)洗脱方式可用梯度洗脱或单液洗脱：

梯度洗脱：A液为前述b(ii)，

          B液为不带盐的缓冲液，

单液洗脱：预先将A液及B液混合并调整其电导度为45-80ms/ml。