[发明专利]以同步化法配合半连续培养法制备高温丁醇菌菌体

说明书

本发明涉及一种菌体的培养方法。具体地说是以同步化法配合半连续培养法制备高温丁醇菌菌体。该方法所得到的菌体可以高转化率地用于石蜡油转化成乙醇和丁醇。

某种厌气性、嗜热性、形成内生孢子的梭菌属细菌可用于限制性代谢生产酵素，抗生素、毒素蛋白质或用于经丙酮-丁醇-乙醇(ABE)发酵法制容剂。详细地说，在含有选择性的防止细胞任意生长的，可缓慢代谢的碳源培养基中，继代培养使该细胞数量和质量上可以同步化。同步化的细胞最少延长到营养细胞的三倍，此时，细胞就成为产溶剂的细菌。同时，如在培养基中添加某一二价阳离子，其浓度不少于0．01M，就可稳定细胞在质量和数量上的同步化。

作为上述理想的梭菌类型是热解糖梭菌(Clostridumthermosachrolgticum)的种类ATCC7956，．NCA3814。其中可利用的种类有C．perfringens ATCC#13124，C．theromocellum ATCC#27405，C．thermohgdrosnlfuricum ATCC#35045，acetobutylicum ATCC#824，C．thermosul-furigenes ATCC#33743，C．thermoacelicum DSM#521，C．thermoautotrophicum DSM#1974，C．beijerinckii ATCC#25752和C．butyricum ATCC#19398。

利用上述菌种，在适当的培养基中进行培养，可制备出产溶剂的细菌，其选择的生长培养基是含有大约0．1-15．0％(W／V)的慢代谢碳源基质的基础培养基。作为这种碳源可包括苦杏仁苷、阿拉伯糖、纤维二糖、丰乳糖、糖原、密二糖、α甲基葡萄糖苷、β甲基葡萄糖苷、棉子糖、水杨苷、淀粉、海澡糖、木聚糖、乙酸钙、丁酸钙、柠檬酸钙、甲酸钙、葡萄糖酸钙和乳酸钙。另外，在培养基内添加二价阳离子Ca、Mg、Mn、Fe或、Zn，并为促使大量二价阳离子被利用，可在培养基中加入超过其溶解度的量，这样，随着过量二价化合物的溶解，此二价阳离子源便构成了进行增殖细胞的合并成分。因而更理想的二价阳离子的浓度为0．1M左右。在上述二价阳离子中葡萄糖钙是最理想的二价离子源，因为它不仅提供所需要的钙离子，而且，还可做为极好的碳源。

通过常规的系列稀释，过滤或离心技术，生长的细胞可以达到同步化。随后，在最适生长的温度下培养，培养的时间是梭菌至少达到1×10⁶个／ml所需的时间，大约一个体积的原培体接种于10个体积的木聚糖培养基，后者作为分批培养。直到增加2-3倍的浓度，即大约1．0-1．5代。如此，再进行分批培养。用来维持细胞按照上述代谢途径进行代谢的生长培养基，常用在木聚糖培养基中补充无机或有机二价阳离子来制备。而进一步如所需终产物只是产溶剂细胞，最好利用含蛋白胨-酵母膏的培养基，并补充有机酸的二价盐作为唯一碳源，其最理想的制备方法是以浓度不小于4．3％(w／v，0．1M)葡萄糖酸钙作为唯一的缓慢代谢的碳源补充于含有通常组成成分的液体蛋白胨-酵母膏培养基中。

徐经上述培养过程的代谢产物可按各种常规方法来收回。例如，如果产物是高温下产生的溶剂，在50℃上，可用下述两种真空发酵的方法回收。一种方法是“实验室有机物导论”，一种现代方法“第548-552页(W．B／Saunder．1976)”；另一种是“用真空的快速乙醇发酵及细胞回收”(生物技术和工程19卷1125-1143页，1977)。

但是，在所有试验过的具体方案中，为了使产生溶剂具有较长时期，延长的同步细胞常常需要一种缓慢代谢的碳源，正常的细胞分裂必须经由温度的交替或添加化学生长抑制剂来防止，以及细胞必须与钙结合，即在通常的生长培养基中必须添加葡萄糖酸钙。另外，培养基的碳源通常为木聚糖，其成本也较高。

本发明的目的是提供一种以同步化法制备高温丁醇菌菌体的方法。该方法中培养可使用更廉价的碳源代替木聚糖，并且也可以不补充二价阳离子，即生长培养基中不用添加葡萄糖酸钙，不但能进一步降低制备菌体的成本，并可结合半连续的菌体培养法，使制备高温丁醇菌菌体适于在工业生产中应用。