[发明专利]携带人肝细胞生长因子基因的重组载体及其在缺血性疾病中的应用

说明书

本发明涉及生物医学领域，具体地说是涉及携带人肝细胞生长因子基因的重组载体及其在缺血性疾病中的应用。

血管闭塞性疾病是一严重影响人类生命健康的疾病。随着外科手术和经皮穿刺的冠状血管成形术等技术的广泛应用，预防和治疗血管闭塞性疾病已取得了很大的进展，病人手术后缺血性器官的血液供应和临床症状均得到了极大的改善。但在手术治疗血管闭塞性血管病的临床应用上存在手术花费高，条件要求严格，危险性大的弊端，目前多集中于条件较好的医院中进行。现代分子生物学技术的发展使基因治疗在许多领域的应用成为现实，基因治疗缺血性疾病的实验研究也已蓬勃发展起来，通过合适的载体介导转移促血管生长因子的基因促进新血管的产生，可在缺血局部形成侧枝循环，建立“分子搭桥”机制。缺血性疾病的基因治疗已展示出了诱人的前景，倍受瞩目。

已知许多基因产物均具有调节血管再生的作用，如血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子和肝细胞生长因子(HGF)等。肝细胞生长因子由间质细胞合成分泌，最初认为它的靶细胞为肝细胞，能够刺激肝细胞进行有丝分裂。后来发现它也是强有力的血管内皮细胞的致有丝分裂原。

综上所述，手术治疗血管闭塞性疾病存在局限，而肝细胞生长因子这一具有较强刺激血管增生作用的细胞因子却未应用于临床。为此我们构建了人肝细胞生长因子的表达质粒pcDNA3-HGF，局部肌肉注射裸露重组DNA后，可明显促进肢体急性缺血部位新血管的形成。因此具有潜在的临床应用治疗缺血性疾病的前景。

 本发明的第一个目的在于提供了一种重组质粒，该重组质粒携带人肝细胞生长因子基因；本发明的第二个目的是应用该携带人肝细胞生长因子的重组质粒治疗缺血性疾病。

本发明的具体实施方案如下：

1．将人肝细胞生长因子编码区cDNA插入到pcDNA3载体的多克隆位点，获得携带人肝细胞生长因子基因的重组载体pcDNA3-HGF，人肝细胞生长因子基因受CMV启动子调控。

2．观察到肝细胞生长因子表达产物能显著刺激血管内皮细胞的增殖。

3．大鼠肢体急性缺血部位局部肌肉注射纯化的重组质粒后，组织化学检测法检测到肝细胞生长因子的表达产物，组织切片上可观察到大量新血管的形成。

本发明提供一种携带人肝细胞生长因子基因的重组载体，该重组载体经纯化后可以被冻干保存，可以配成注射液等用于治疗缺血性疾病病人。缺血性疾病可以是外周血管病，也可以是心肌缺血和其他器官的缺血。实施例将通过描述携带人肝细胞生长因子的重组载体对外周血管病的基因治疗作用来进一步阐述本发明。

应用本发明提供的重组载体治疗缺血性疾病是从促进血管生成、建立侧枝循环和改善局部血液循环的目的入手，向患者体内导入促血管生成因子HGF的基因。因此应用本发明提供的重组载体比手术治疗等疗法更加简单方便，成本也更低廉。若本发明得以实施，将为目前缺血性疾病的临床治疗提供一种可供选择的新的治疗手段。

结合附图进一步说明本发明：

图1。pcDNA3-HGF的结构示意图1．CMV增强子/启动子2．肝细胞生长因子基因3．牛生长激素基因的poly A信号和转录终止序列4．SV40复制起始片段5．E.coli复制起始位点6．氨苄青霉素抗性基因等序列图2。pcDNA3-HGF的酶切鉴定电泳图1．lambda DNA/EcoRI+Hind Ⅲ Markers2．BamH Ⅰ单酶切的pcDNA3-HGF3．Bam HI+Apa Ⅰ双酶切的pcDNA3-HGF，大小2.2kb左右的条带为HGFcDNA3．Bam H Ⅰ单酶切的pcDNA3空白对照质粒图3。原代骨骼肌细胞转染肝细胞生长因子基因后VEGF的表达(.)转染pcDNA3-HGF后原代骨骼肌细胞表达的VEGF(。)转染pcDNA3后的细胞上清图4。肝细胞生长因子表达产物对原代人脐静脉内皮细胞增殖的刺激活性(.)转染pcDNA3的对照无血清细胞上清对内皮细胞的增殖作用(。)转染pcDNA3-HGF的无血清细胞上清对人脐带内皮细胞的刺激活性*统计学处理两者有显著性差异(P＜0.01)图5。免疫组织化学法分析质粒注射局部肌肉中HGF的表达水平(A)pcDNA3-HGF转染的肌肉(B)pcDNA3转染的肌肉图6。缺血后肢骨骼肌组织切片的HE染色(A)转染pcDNA3-HGF的动物，有大量新血管形成(B)转染pcDNA3的动物

实施例：1、质粒的构建及制备(1)质粒的结构人HGF cDNA由人胎盘cDNA文库中分离得到，然后亚克隆至真核表达载体pcDNA3的多克隆位点。见附图1和图2。(2)质粒的制备