[发明专利]新氨基转移酶在氨基转移中的应用

说明书

L-2-氨基-4-甲基膦基丁酸(下面用L-Phosphinothricin或L-PPT表示)或它的盐是化学容易得到的消旋体的有效成分，正如DE-OS 2939269已公开的。按照DE-OS 2717440，后者对于多种单子叶和双子叶、一年生和多年生的杂草具有很好而且广泛的除草剂效果。因为L-PPT和它的上述衍生物与消旋化合物相比功效强大约2倍，早就想望有一个方法能以简单的方式、较大量地得到L-PPT。

已知L-PPT可以通过微生物的生物转化进行生产(LP 0248357)，在该专利申请中还提及，大肠杆菌DH-1具有氨基转移酶，该酶可以把相应的前物质转化成L-叔，L-亮氨酸和L-PPT。

现已发现，大肠杆菌DH-1合成一种特殊的氨基转移酶，它对于生产L-PPT具有意外的特异性。

本发明涉及：

1.一种来自大肠杆菌DH-1的氨基转移酶，它具有：

——20,000至250,000道尔顿的分子量

——PH3.0至8.0的等电点

——PH最佳范围为5.0至10.0

——对于L-PPT，γ-氨基丁酸和谷氨酸作为氨基供体以及相应的酮化合物作为受体的底物的特异性。

2.特征如1的氨基转移酶的一种生产方法，其特征在于培养大肠杆菌DH-1并分离所说的氨基转移酶。

3.具有如特性1的氨基转移酶用作将(3-羧基-3-氧代丙基)-甲基-次膦酸转变为L-Phosphinothricin和将琥珀酸半醛转化成γ-氨基丁酸的应用。

下面将详细地说明本发明，特别是本发明的最佳实施例，此外由权利要求限定发明。

氨基转移酶是从大肠杆菌DH-1或它的突变体或变种分离的，为此，在该微生物生长的最佳营养介质中培养该微生物。微生物的培养例如在振荡烧瓶或发酵器中在需氧、振荡或搅拌下进行，需要时导入空气或氧。发酵可以在约20℃至40℃的温度下进行，25℃至37℃较好，最好在30℃至37℃。培养胨的PH范围为5至8.5之间，最好在5.5至8.0之间。在该条件下，一般在1至3天后可以看到所提及的酶的积累，氨基转移酶的合成在对数期的中间开始，在对数期的结束达到它的最高值。酶的产生可以通过HPLC分析或光度法测定活性而进行跟踪。

生产该氨基转移酶所使用的营养液含有0.2至5％、最好是0.5至2％的有机氮化合物以及无机盐，作为有机氮化合物，可考虑氨基酸胨、此外肉提取物，碾碎的种子，例如玉米、小麦、豆类、大豆或棉的种子、酒精生产的蒸馏残渣、肉粉或酵母提取物。营养液中可以含有无机盐，例如碱或碱土金属、铁、锌或镁的氯化物、碳酸盐、硫酸盐或磷酸盐，还有铵盐和硝酸盐。

该酶可以通过经典的溶菌酶溶解硫酸铵沉淀、离子交换层析和凝胶渗透色谱法实现其分离和纯化。

该酶的特性：分子量20,000至250,000道尔顿，25,000至100,000为好，最好是40,000至50,000道尔顿，等电点PH值为3.0至8.0，最好是3.5至5.5，特别是4.0至5.0。酶产品的最佳PH是5.0至10.0，特别是8.0至9.0。

用气相定序分析测定精制的氨基转移酶的N-末端最初33氨基酸为：Met-Asn-Ser-Asn-Lys-Glu-Leu-Met-Gln-Arg-Arg-Ser-Gln-Ala-Ile-Pro-Arg-Gly-Val-Gly-Gln-Ile-His-Pro-Ile-Phe-Ala-Asp-Arg-Ala-Glu(Thr)-Asn-Asn(Gly)。

该氨基酸序列表明与已有文献中已知的氨基转移酶没有同源性。

该氨基转移酶可以被文献已知的抑制剂0-(羧甲基)-羟胺所抑制。在标准试验条件下(例3，酶活性)被大约0.1至1μm的0-(羧甲基)-羟胺抑制50％。

测定证明，该酶对于高温出乎意料地稳定，因此在纯化时，可以利用酶在70℃连续培育10分钟，使其它的蛋白质由于热变性而与该氨基转移酶分离。

用本发明的氨基转移酶不能生产20种蛋白基因氨基酸，它仅对于(3-羧基-3-氧化丙基)-甲基次膦酸以及丁二酸半醛或它们的盐具有特异性，通过谷氨酸的氨基的转移可以由它们生产无蛋白基因氨基酸L-PPT以及γ-氨基丁酸，作为相应的酮酸酯，可以加入低级烷基(C₁-C₆)酯。