[发明专利]菊欧氏杆菌小分子细菌素及其发酵提取方法

说明书

本发明菊欧氏杆菌小分子细菌素及其发酵提取方法，属于微生物发酵工艺和化学领域，专用于菊欧氏杆菌小分子细菌素的发酵提取。

菊欧氏杆菌(Erwinia chrysanthemi)是一种重要的植物病原细菌，能引起马铃薯、大白菜软腐和水稻基腐等重要植物病害。产细菌素是细菌中存在的普遍现象。绝大多数的细菌素研究仅限于一般的性状描述，对其理化性质、遗传背景等问题均未加以阐明，鉴定了细菌素分子结构的例子就更少，这在一定程度上限制了细菌素的开发利用。菊欧氏杆菌的细菌素最早于1961年由Y.Homan发现和研究。1979年，E.Echandi对菊欧氏杆菌的细菌素的形态和性状进行了详细研究，认为菊欧氏杆菌的细菌素是一种热不稳定、抗蛋白酶，形态上与噬菌体尾部相似的高分子蛋白。1985年，E.Dominique等对9株菊欧氏杆菌产生的细菌素进行了研究，认为菊欧氏杆菌的细菌素为低分子蛋白，对热不敏感，与大肠杆菌素相似。1987年，发明人在以B3菌株为材料研究菊欧氏杆菌细菌素时发现菊欧氏杆菌产生能通过透析膜的小分子细菌素，命名为Echcin。

Echcin对多种动植物病原菌，甚至癌细胞具有很强的抑制作用。然而，菊欧氏杆菌B3菌株在多种液体培养基中培养都不分泌Echcin，这给提取分离工作带来了困难。

本发明的目的在于提供细菌素Echcin发酵提取工艺，提高发酵产量，将Echcin提取纯化，鉴定Echcin分子结构，为Echcin的开发利用奠定基础。

本发明所提供的菊欧氏杆菌小分子细菌素Echcin为一类生物碱。分子量为：600-900，其化学结构基本骨架为：0≤n≤3，含有5个氨基和1个羟基，氨基可位于R₁，R₂，R₃，R₄，R₅，R₆六个位置中任意5个位置。

其中四种细菌素的结构分别为①1，11，19，27，35-五氨基-3-羟基四十烷，分子量为653；②4，14，22，30，38-五氨基-6-羟基四十三烷，分子量为695。③6，7，17，24，32，40-五氨基-9-羟基四十三烷，分子量为739；④7，18，26，34，42-五氨基-10-羟基四十九烷，分子量为793。

Echcin可以与盐酸形成盐酸盐，其盐酸盐极易溶于水，但在水中加入氯化纳时可使细菌素的溶解度大幅度降低。

本发明所述Echcin的发酵方法为：

(1)种子培养：菊欧氏杆菌B3菌株活化后挑取单菌落，NB培养基28℃-30℃下培养15-28hr。

(2)发酵罐培养：采用10升的发酵罐在26-28℃，pH为5-8，每小时通气500-800升，搅拌器转速500-600转/分/罐压0.4-0.6磅/立方厘米的条件下进行发酵，发酵时间为28-30hr。接种量为1-10％。发酵期间用溴麝香草酚蓝对发酵质量进行快速检测。

发酵培养基(1L)配方为糖5-20克，氨基酸1-3克，盐0.5-3克，氨水调pH至7。

本发明所述Echcin的提取方法为：

1.发酵液离心后取上清液，用NaOH调pH8-12，离心后得上清液A和沉淀物B。

2.取上述沉淀物B加无水乙醇溶解后得乙醇液C和不溶物D。

3.取上清液A调pH4-5后，加NaCl至0.5-1.5M，再加10-30％正丁醇(V∶V)，取正丁醇相加90-100％乙酸乙酯(V∶V)后得沉淀物E和液相F。

4.沉淀物E和不溶物D合并，加5-20％盐酸水(pH4.0，V∶V)，取水溶液调pH8-12，离心后得沉淀物，即为Echcin I粗品，定为组分I。

5.液相F加40％-60％水(V∶V)，取下相与乙醇液C合并后，调pH8-12，加90-100％乙酸乙酯(V∶V)，取酯相加40-60％盐酸水(pH4.0，V∶V)，取水相加NaCl至1-3M，加5-15％正丁醇(V∶V)，取正丁醇相加2-8倍体积乙酸乙酯，析出Echcin I、II、III、IV和IV混合粗品，定为组分II。

6.组分I主要含Echcin I型细菌素，采用琼脂糖凝胶电泳方法获得Echcin I纯品。

7.组分II中含有Echcin II-V型四种细菌素，分离方法是：