[发明专利]短串联重复序列等位基因阶梯的制备技术

说明书

本发明属于基因工程，具体地说涉及一种短串联重复序列等位基因阶梯的制备技术，该技术可应用于法医学、考古学、遗传学和肿瘤学等领域的个体识别、亲权鉴定以及遗传和肿瘤病的诊断等方面。

人类基因组DNA有3×10⁹bp，其中10％是串联重复序列，被称为卫星DNA。按重复单位的长短，又可分为大卫星、中卫星、小卫星和微卫星。其中重复单位仅由2-7bp组成的叫微卫星，所以又称为短串联重复序列(Shorttandem repeat，SIR)。不同人体基因组的卫星DNA重复单位的数目是可变的，因此形成了极其复杂的等位基因片段长度多态性。根据这一规律，近几年在法医学、考古学、遗传学和肿瘤学等领域建立了一种崭新的对人体进行个体识别、亲权鉴定以及对遗传和肿瘤病进行诊断的STR-PCR(短串联重复序列聚合酶链反应)技术，从而给这些领域的发展带来了新的革命性变化。在这一技术中，为了准确地给各等位基因进行定位和识别，必须设置与各等位基因相对应的等位基因阶梯(Allele Ladder)为标准参照物(Markers)。因等位基因阶梯中的每一基因片段的长度均是已知的，将它与各待测样品的扩增产物在相同电泳条件下的相邻泳道上进行电泳分离，染色后进行对比，就很容易判断待测样品的基因型，所以，等位基因阶梯在STR-PCR的结果判断中至关重要。

目前国内制备各STR位点等位基因阶梯的方法有两种：一种是从人基因组的每个位点上筛选能代表各等位基因片段的几种扩增产物，混合后直接用于AlleleLadder；另一种方法是将能代表某位点上所有等位基因的扩增产物混合物，稀释后再次扩增，将再次扩增的产物用作等位基因阶梯。

按上述方法制备的等位基因阶梯有很多不足之处：

(1)、直接选择人基因组作为扩增模板时，往往出现有些带是重复扩增，而有些带确很难找到相应的的扩增模板，由此制备的等位基因阶梯的各条带的颜色深浅不一，甚至出现缺带现象。

(2)、要批量生产，必须要经常去挑选和制备能代表所有等位基因片段的模板，不但工作量大，而且每次用的同一模板的纯度及含量等均有出入，使其扩增条件难以标准化。

(3)、人基因组DNA的分子量太大，结构极其复杂，难以线性化和解链，所以扩增产物的产量较低，而且非特异扩增较严重，对产物的纯化较困难，不适合批量生产。

(4)、若用人基因DNA的扩增产物混合后再次进行扩增，其非特异扩增更加严重，扩增产物中各条带的颜色更不均一，此法更不适合批量生产。

(5)、将扩增产物的混合物直接用于等位基因阶梯时，在短时间内可能出现降解，使其各条带模糊不清，或者构型有所改变，使其电泳迁移率发生变化。由于这些原因引起的质量变化均不能作为标准参照物使用。

由于上述原因，至今尚无任何单位可以批量生产一种稳定的STR等位基因阶梯供给有关部门使用。

本发明的目的就是为了提供一种短串联重复序列等位基因阶梯的制备技术，该技术能批量生产稳定性好的(即在常温以下至少在一年之内不出现降解和构型改变，在各种浓度的变性或非变性胶中均保持与扩增产物的电泳迁移率一致)，既可用于银染法，也可用于荧光法的等位基因阶梯试剂。

一种短串联重复序列等位基因阶梯的制备技术，其特征在于包括以下生产顺序步骤：

1、从人的有核细胞中提取DN/A：取抗凝血20μl，加红细胞裂解液D.5ml左右，充分混匀后，5000rpm离心5分钟，再用红细胞裂解液洗两遍，沉淀加20μl白细胞裂解液，混匀后，100℃煮10分钟，取1μl进行STR-PCR扩增；

2、按国内外公开发表的各STR位点PCR方法进行扩增，以寻找各位点的等位基因型；

3、按德国QIAGEN公司生产的QIAquickGel Extraction Kit(或其它公司的同类产品)说明书，快速纯化PCR产物；

4、按Promega公司生产的pGEM-TVector Systems(或其它公司的同类产品)说明书将纯化的PCR产物连接到T载体上；

5、按《分子克隆》第二版中文版第19页的方法提取质粒DNA，并进行纯度和定量测试；

6、用STR-PCR技术分别制备各等位基因片段，然后对扩增产物进行纯化和定量测定；

7、将各位点的等位基因片段进行序列分析，以测定各片段的bp数及串联重复单位数；

8、将各片段等量混合后，加入稳定剂，并按适当量分装；

9、出厂前再次进行电泳检测。

本发明有如下的特点：