[发明专利]一种改良杂交稻恢复系抗性的方法

权利要求书

1.一种改良杂交稻恢复系抗性的方法，包括杂交，回交，抗性鉴定和分子标记检测方法，其特征在于，采用一次杂交，三次回交和一次自交的育种程序，将目标基因导入到待改良的杂交稻恢复系中，采用聚合酶链式反应(PCR)检测并选择与目标基因共分离和/或紧密连锁的分子标记基因型，使含有目标基因的导入片段尽可能小，应用扩增片段长度多态性(AFLP)标记对遗传背景实施选择，使除开目标基因区段之外，改良型恢复系基因组与原恢复系相同，并对改良型恢复系进行抗性鉴定，繁殖和杂种生产。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述改良杂交稻恢复系抗性的方法采用如下步骤：

a.以含有目标抗性基因的品系为供体亲本，以待改良的杂交稻恢复系为轮回亲本，二者杂交，所得杂种一代(F₁)再与轮回亲本回交，得到回交一代(BC₁F₁)；

b.对BC₁F₁单株进行PCR检测，选出含目标基因者进行AFLP筛选，选出轮回亲本遗传背景最多的单株再与轮回亲本回交，得到回交二代(BC₂F₁)；

c.对BC₂F₁单株进行PCR检测，选出含目标基因且在该基因一侧与紧密连锁的分子标记发生交换者进行AFLP筛选，选出轮回亲本遗传背景最多的单株再与轮回亲本回交，得到回交三代(BC₃F₁)；

d.对BC₃F₁单株进行PCR检测，选出含目标基因且在该基因另一侧与另一紧密连锁的分子标记发生交换的单株，套袋自交，得到BC₃F₂；

e.对BC₃F₂单株进行PCR检测，选出目标基因纯合者进行AFLP筛选，选出除目标基因区段外的遗传背景全为轮回亲本的单株，即为改良型恢复系。

3.根据权利要求1或2所述方法，其特征在于，所述PCR检测方法包括：

a.PCR反应体系为，各待检测单株的DNA各10-50ng，依据与目标基因共分离或紧密连锁的分子标记设计的特异正向引物和反向引物各0.25uM，Taq DNA聚合酶各0.5-1.5U，四种脱氧核糖核苷酸dATP，dTTP，dGTP和dCTP各0.1mM，Tris-HCl(pH8.3)和KCl各10mM，以及MgCl₂各2mM，PCR反应体积为15-25uL；

b.PCR循环程序为，首先在94℃变性3-5分钟，然后在94℃变性30-45秒，50-60℃退火0.5-1.5分钟，72℃延伸1-2分钟，运行25-40个循环，最后在72℃延伸5-8分钟；

c.PCR产物的检测为，在1％-1.4％的琼脂糖凝胶上点样，在50-100伏直流电压下电泳4-6小时，进行溴化乙啶染色，置于紫外光下读取各样品的PCR带型，确定各样品的分子标记基因型。

4.根据权利要求1或2所述方法，其特征在于，所述AFLP筛选遗传背景的方法包括如下步骤：

a.在37℃对各待测单株的DNA进行限制性内切酶MseI和EcoRI双酶消化3小时后，再加入T4 DNA连接酶，继续温育3小时；

b.加入EcoRI+1引物和MseI+1引物以及Taq DNA聚合酶在60℃的退火温度下进行选择性预扩增；

c.在另一管中加入EcoRI+3引物、T4激酶和γ-³²P[ATP]，在37℃温育0.5小时，对EcoRI+3引物进行末端标记；

d.加入预扩增产物、EcoRI+3引物、MseI+3引物以及Taq DNA聚合酶，在65℃的退火温度下进行选择性扩增；

e.PCR产物在6-8％的聚丙烯酰胺凝胶上点样，在70瓦功率下电泳2.5-3.5小时后，揭下凝胶，放射自显影3-24小时；

f.在放射自显影的X光胶片上读取各样品的AFLP带型，计算各样品恢复轮回亲本基因型的比率。